金邊祛風飲對類風濕關節炎滑膜細胞IL-1β、TNF-α及MMP-3表達的影響①

向 導 袁 林 蘇林沖 向 陽 (湖北民族學院附屬民大醫院，恩施 445000)

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種病變累及周圍關節的多系統性炎癥性的自身免疫病，主要表現為慢性、對稱性、多滑膜關節炎和關節外病變［1］。常因沒有早期診斷和治療，而在發病兩年內即可出現不可逆的骨關節破壞，造成關節畸形以及功能喪失，最終殘疾［2］。滑膜組織的改變在類風濕關節炎中最為顯著，病變滑膜(液)中有大量浸潤的巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒細胞，這些炎性細胞和滑膜中固有細胞相互作用，造成骨和軟骨的破壞，因此，抑制自身免疫反應的細胞增殖及促進該免疫反應的細胞凋亡，阻止關節滑膜中炎性細胞的浸潤可減輕關節炎病變，是治療關節炎的一條重要途徑［3］。

本實驗采用本院自制藥劑復方金邊祛風飲(每100 ml生藥含量為金邊七15 g、見血飛20 g、人血草12 g、香雪藤 15 g、破血丹 15 g、穿山龍 15 g、雪里見15 g、赤芍20 g、竹節參15 g)為治療藥物，實驗觀察藥物對培養的類風濕關節炎患者膝關節液滑膜細胞的改變及炎性細胞因子IL-1β、TNF-α和MMP-3的影響，探討金邊祛風飲在類風濕關節炎中的運用。

1 材料與方法

1．1 材料 RA和OA患者膝關節關節液取自本院風濕免疫科患者，其中類風濕關節炎(RA)6例，骨關節炎(OA)6例。標本采集前2周，患者均未使用過激素類或免疫抑制劑類藥物，其中RA依照1987年美國風濕病學會(ACR)標準;OA患者診斷按ACR1986年標準。本研究均獲得研究對象知情同意。

細胞完全培養液的配制:含DMEM(高糖)培養基84% ～89%、胎牛血清10% ～15%、HEPES 1%。加入雙抗(青霉素+鏈霉素)貯存液，使青霉素和鏈霉素的終濃度均為100 U/ml，調節pH 值7．0～7．2，于4℃保存。

1．2 方法 患者在無菌條件下行膝關節穿刺術，取其關節液后置含肝素鈉的離心管中，在4℃，1 000 r/min離心10分鐘;棄上清，用DMEM完全培養基重懸細胞，將收集到的細胞接種于細胞培養瓶，置于培養箱，5%CO2、37℃培養;細胞貼壁后，每2～3天更換1次培養液，并用D-hank’s漂洗培養瓶，去除懸浮的非貼壁細胞，重復2～3次;待細胞長滿后，用0．25%EDTA胰蛋白酶消化細胞，按1∶3比例傳代，復種于6孔無菌細胞培養板中，本例選用第2代生長穩定的滑膜細胞進行實驗。

1．2．1 分組 根據前期研究發現當金邊祛風飲藥物濃度為0．65 mg/ml時，滑膜細胞死亡較多，當藥物濃度為65μg/ml時，細胞形態無明顯變化;當藥物濃度為6．5μg/ml時，生長狀態良好，故將藥物濃度選在6．5～65 μg/ml。分別設藥物濃度10 μg/ml為低劑量組、30μg/ml為中劑量組、60μg/ml為高劑量組。

1．2．2 細胞培養液上清液中炎性因子 取生長良好的RA和 OA滑膜細胞，按細胞濃度為1×103ml－1，每孔100 μl接種于96孔培養板，置入二氧化碳培養箱，待3～4小時細胞貼壁后再補液至200 μl。培養24小時后，吸去懸浮細胞，在每孔中分別加入金邊祛風飲，濃度分別為 10、30、60 μg/ml，刺激細胞72小時，收集上清。用ELISA法分別檢測其中的 TNF-α、IL-1β 和 MMP-3水平。

1．2．3 滑膜細胞增殖率 取生長良好的RA和OA滑膜細胞，調整細胞濃度，接種于無菌96孔板(每板第一個孔不接種細胞，只加培養液，為空白凋零孔)，加入細胞懸液與培養液各100μl;置于37℃、5%CO2培養箱孵育，至細胞單層鋪滿孔底，24小時后加入金邊祛風飲，藥物濃度分別為10、30和60 μg/ml，陰性對照組，常規換液;每組設5個復孔，每孔100μl;于5%CO2，37℃培養箱中孵育16～48小時后，在倒置顯微鏡下觀察;每孔分別加入5 mg/ml(0．5%)的 MTT溶液20μl，繼續培養4小時。離心，棄培養液，用D-hank’s液沖2～3遍，再次加入培養液后終止培養，小心將每孔內的培養液吸去;每孔分別加入二甲基亞砜(DMSO)150μl，置搖床上低速振蕩5～10分鐘，讓結晶物充分溶解。酶聯免疫檢測儀測定每孔吸光度(490 nm波長處)。

2 結果

2．1 滑膜細胞的形態學改變 給藥刺激前培養的RA、OA組細胞貼壁生長，幾乎無脫落，胞漿飽滿，生長舒展，相鄰細胞生長融合成片(見圖1A、C);經金邊祛風飲刺激72小時后，光鏡下可見RA滑膜細胞密度有一定程度降低;細胞形態亦發生相應改變，細胞體積明顯縮小，部分由貼壁脫落呈懸浮生長，貼壁能力減弱，細胞核出現固縮，細胞膜完整(見圖1B);而在OA治療組，細胞體積與給藥前變化不明顯，細胞密度較前有所降低，仍以長梭形細胞多見，大部分細胞仍呈貼壁狀，細胞透明性加強(見圖1D)。

2．2 上清中 TNF-α、IL-1β 和 MMP-3水平 ELISA法檢測培養上清液中細胞因子和基質金屬蛋白酶的結果見表1。不同濃度金邊祛風飲刺激滑膜細胞72小時后，培養上清液中的 TNF-ɑ、IL-1β、MMP-3 均降低，與OA對照組比較有顯著差異(P＜0.05)，與空白對照組相比具有極顯著性差異(P＜0.01)。組間比較，高劑量組在降低TNF-α、IL-1β和MMP-3水平中有顯著性差異(P＜0.05)

2．3 RA及OA滑膜細胞增殖率 濃度分別為10、30、60μg/ml的金邊祛風飲刺激 RA、OA滑膜細胞72小時(同時設空白對照)，細胞的增殖率見表2，結果顯示，與OA對照組相比，RA滑膜細胞在3個濃度梯度，均能引起增殖率顯著增高，而OA滑膜細胞在各藥物濃度刺激下，細胞增殖率沒有顯著改變。

表1 細胞培養液上清液中IL-1β、TNF-ɑ、MMP-3的測定 ±s，n=6)Tab．1 Determ ination of cell culture supernatant of IL-1β，TNF-αand MMP-3 ±s，n=6)

表1 細胞培養液上清液中IL-1β、TNF-ɑ、MMP-3的測定 ±s，n=6)Tab．1 Determ ination of cell culture supernatant of IL-1β，TNF-αand MMP-3 ±s，n=6)

Note:Compared RA high dose group with RA controlgroup，1)P＜0.01;Compared RA treatmentgroup with OA treatmentgroup ，2)P＜0．05;Compared RA high dose group with RA low dosegroup，3)P＜0．05．

Groups TNF-ɑ(ng/ml)IL-1β(ng/ml)MMP-3(ng/m l)RA control 115．90±5．19 127．42±4．83 431．20±3．69 RA high dose 31．98±3．271)2)3) 27．39±1．741)2)3) 294．30±7．121)2)3)RA middle dose 67．39±1．892) 69．77±1．892) 327．62±5．322)RA low dose 72．67±2．792) 75．06±0．972) 349．27±3．832)OA high dose 85．41±2．49 85．95±1．39 386．64±4．37 OA middle dose 85．45±2．31 86．31±2．21 384．91±6．99 OA low dose 86．69±2．45 87．43±1．46 386．34±6．15

圖1 倒置顯微鏡下RA及OA滑膜細胞形態變化(×40)Fig．1 Inverted in m icroscope RA and OA synovial cell morphological changes(×40)

表2 MTT法檢測滑膜細胞增殖 ±s，n=6)Tab．2 MTT assay proliferation of synovial cells ±s，n=6)

表2 MTT法檢測滑膜細胞增殖 ±s，n=6)Tab．2 MTT assay proliferation of synovial cells ±s，n=6)

Groups n Inhibition ratio(%)RA control 6 2．25±3．14 RA high dose 6 39．26±2．461)2)3)RA middle dose 6 28．41±3．252)RA low dose 6 22．41±1．682)OA high dose 6 8．57±3．24 OA middle dose 6 7．71±2．38 OA low dose 6 7．37±2．12

3 討論

由類風濕性滑膜中的巨噬細胞、纖維母細胞或滑液中的中性白細胞生成的炎性因子TNF-α和IL-1β在RA的病情進程中處于中心地位。TNF-α和IL-1β在活動性類風濕關節炎中主要參與病理的過程是:刺激多形核細胞和結締組織細胞，產生前列腺素等小分子炎癥介質;激活血管內皮細胞，增強內皮細胞粘附分子的表達，在關節炎時，正是通過與粘附分子的互相作用，使血液中的白細胞被匯集到關節腔內;通過刺激骨膜細胞和破骨細胞、軟骨細胞，使糖蛋白的合成減少、降解增加，同時產生釋放骨鈣的膠原酶和其他中性蛋白酶，從而導致骨和軟骨破壞［4］。大量研究證實RA患者關節滑液和外周血TNF-α和IL-1增高與RA患者關節滑膜液的巨噬細胞及外周血單核細胞分泌TNF-α及IL-1有關。經發現由T細胞分泌的淋巴毒素(Lymphotoxin，LT)與腫瘤壞死因子同時作用于相同受體，并且兩者在氨基酸序列上的同源性較高，遂將淋巴毒瘤命名為TNF-β，將原來的腫瘤壞死因子命名為 TNF-α。TNF-α是一種具有主要的免疫調節和前炎性等多方面功能的細胞因子，且能夠引起腫瘤組織的出血壞死。TNF-α在關節病變中，刺激軟骨細胞和滑膜細胞合成膠原酶與前列腺素E2(Prostaglandin E2)，促進成纖維細胞的增生，致使骨和軟骨的吸收破壞。Yocum［6］認為在疾病活動期或進展期，TNF-α 進入外周血流，同時自身高水平分泌，從而導致局部關節組織的破壞，以及一系列臨床癥狀，而在疾病的慢性期，TNF-α分泌水平相對偏低且較穩定。TNF-α在正常人血清中約(4～5 ng/ml或0～2 U/ml)，滑液中為35 pg/ml，而在RA病人外周血中其水平明顯升高。(RA病人血清中為4．3～330 pg/ml;滑液中為120 ～137 pg/ml)［7］。IL-1β 這一炎性細胞因子在RA滑膜增生與關節破壞中發揮著重要作用，現認為局部的巨噬細胞被關節內免疫復合物活化，分泌大量的IL-1，進而使細胞因子網絡活化，活化的細胞因子網絡誘導關節腔內的單核細胞及中性粒細胞浸潤，介導關節滑膜炎癥的發生與發展［8］。研究還發現，IL-1mRNA也高表達于類風濕關節炎患者的外周血細胞中，所以血清IL-1β濃度與關節液內IL-1β含量有相當密切的關系［9］。可以看出，IL-1β不僅作用于RA細胞免疫的激活，而且還與機體整體的體液免疫有關。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組含Zn2+的蛋白水解酶，其作用之一是使細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)的所有蛋白成分降解，導致韌帶、軟骨及骨的破壞。MMPs的活化被認為是ECM降解的限速環節［10］，在此過程中還可使其他的 MMPs激活，此效應在組織塑型、胚胎發育中起著極其重要的作用。機體組織內的金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue inhibitor ofmetalloproteinases，TIMPs)可抑制MMPs的活性，在正常機體中，MMPs與TIMPs之間保持著一種動態平衡的格局，一旦這種平衡的格局被打破，多種病理過程就隨之產生［11］。MMPs廣泛存在于各種結締組織中，現代研究認為MMP-1、MMP-3與類風濕關節炎關系最為密切，是導致關節被破壞的重要因素，在晚期類風濕性關節炎患者的關節滑膜中，MMP-1、MMP-3 水平表達更高［12］。MMP-3的mRNA水平在類風濕關節炎的關節軟骨與血管翳連接部位明顯升高，證明其在類風濕關節炎患者的骨與軟骨的破壞中起重要作用，類風濕關節炎患者血清中MMP-3水平增高被認為源自關節，其原因為:①滑液中MMP-3水平比在血清中高250倍;②隨受損關節數量增多，血清MMP-3水平亦相應增高;③在關節腔內局部注入皮質類固醇之后，血清MMP-3水平明顯下降［13］。MMP-3這一系統性的炎癥標志物，現已被認為是誘導軟骨降解最重要的蛋白酶，并可作為類風濕關節炎患者滑膜損傷以及預后的指標。

金邊祛風飲能有效抑制類風濕關節炎滑膜細胞增殖，以及調節炎性細胞因子IL-1β、TNF-α的分泌及MMP-3表達，可能為其重要作用機制，從而使關節炎癥減輕。本研究為金邊祛風飲治療類風濕關節炎的臨床應用提供了試驗依據，為今后更加深入地研究金邊祛風飲奠定了基礎。

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