LCQG對MRL/lpr狼瘡鼠抗ds-DNA抗體、IgG、IgA水平的影響①

梁 濤 瞿凌晨 梁 衛(wèi) 呂高虹 許 立 (南京中醫(yī)藥大學藥理教研室，南京 210023)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一個累及腎、肝、心等臟器，臨床表現(xiàn)復雜，病程遷延反復的自身免疫性疾病，該病會導致免疫紊亂，從而導致自身抗體產(chǎn)生、免疫復合物形成和補體活化。西醫(yī)多采用腎上腺皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療本病，但由于SLE本身的復雜性以及上述藥物長期使用的嚴重副作用，故尋找安全有效、副作用小的治療藥物仍為當務之急。中醫(yī)藥對SLE的治療效果已得到國內(nèi)外學者的充分肯定，具有改善和調(diào)節(jié)免疫功能，毒副作用小，可長期給藥等優(yōu)點。本文研究的狼瘡清顆粒是從《備急千金要方》所載的犀角地黃湯中而來，是在名老中醫(yī)周仲英教授指導下對犀角地黃湯進行加減而成，具有清熱解毒、涼血化瘀、滋養(yǎng)陰液功效。我們對其進行了主要藥效學研究，觀察其對二甲苯所致ICR小鼠耳腫脹、MRL/lpr自發(fā)性紅斑狼瘡小鼠尿蛋白、血清抗ds-DNA抗體、IgG水平、腎組織中免疫球蛋白IgG、IgA沉積的影響進行研究，為今后開發(fā)新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 動物 ICR小鼠，18～22克，雄性，南通大學實驗動物中心，合格證號:SCXK(蘇)2008-0010;MRL/lpr狼瘡鼠:雌性，8周齡，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK-(軍)2007-004。

1．2 藥品與試劑 狼瘡清顆粒(LCQG):南京中醫(yī)藥大學提供，藥物主要組成:水牛角片12 g，生地12 g，白花蛇舌草20 g，漏蘆10 g，炙僵蠶10 g，秦艽10 g，丹皮 10 g、赤芍 12 g，陳皮 6 g，制黃精 10 g，炒白術(shù)10 g等;批號100510，100726。阿司匹林(Aspirin):阿斯特拉制藥有限公司，批號:20100121;潑尼松(Prednisone):天津藥業(yè)公司，批號:100309。dsDNA檢測試劑盒和IgG檢測試劑盒:由上海藍基生物有限公司提供;尿蛋白試劑盒:由南京建成生物有限公司提供;DAPI染色試劑盒、FITC-羊抗小鼠IgG抗體:南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供;FITC-羊抗小鼠IgA抗體:SANTA CRUZ，貨號:sc-3692;二甲苯、甲醇、乙醇、枸櫞酸三鈉等其它試劑:均為國產(chǎn)分析純。

1．3 儀器 熒光倒置顯微鏡OLYMPUS;耐高溫塑料染色架:福州邁新;FA1004電子天平;上海天平廠;切片機:美國 Reichert HistoSTAT;孵箱:上海精宏實驗設備有限公司;烤箱:上海圣欣科學儀器有限公司101AS-3;SyneRgy HT酶標儀:美國Bio-Tek。

1．4 二甲苯所致ICR小鼠耳腫脹的造模、分組及給藥 ICR雄性小鼠50只，體重18～22 g，按體重隨機分為5組，每組10只。(1)模型組:給予等體積的蒸餾水;(2)阿司匹林組(Aspirin):0．6 g/kg;(3)LCQG小劑量組:11．4 g/kg;(4)LCQG中劑量組:22．8 g/kg;(5)LCQG 大劑量組:45．6 g/kg;給藥體積10 ml/kg，LCQG各劑量組當天灌胃給藥3天，末次給藥45分鐘后，于小鼠右耳兩面涂二甲苯0.05 ml/只致腫，左耳不涂為正常耳。

1．5 腫脹抑制率的計算 45分鐘后脫頸椎處死小鼠，用9 mm打孔分別在左右耳相同部位打下圓片，電子天平稱耳片重，腫脹度=每鼠右耳重量-左耳重量。腫脹抑制率(%)=(模型組平均腫脹度－給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度×100%。

1．6 MRL/lpr狼瘡鼠的分組及給藥 取MRL/lpr小鼠32只，雌性，8周齡，飼養(yǎng)至90日齡，隨機分成4組，每組8只，模型組:MRL/lpr小鼠給予蒸餾水;中藥治療組 ig LCQG 45．6g/(kg·d);西藥組:ig prednisone 10 mg/(kg·d);中藥組+西藥治療組 ig LCQG 45．6 g/(kg·d)+prednisone 10 mg/(kg·d)，給藥體積0．1 ml/10 g，連續(xù)給藥6周，于第6周末進行以下各項指標檢測。

1．6．1 血清ds-DNA抗體、IgG和尿蛋白測定 小鼠摘除眼球取血，離心取血清，采用ELISA法測定血清ds-DNA抗體、IgG含量，參考說明書步驟操作，于450nm處檢測吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品中ds-DNA抗體、IgG含量;小鼠代謝籠收集24小時尿液，考馬斯亮藍法檢測尿蛋白定量。

1．6．2 腎臟熒光免疫組化IgG、IgA的檢測 小鼠脫臼處死，迅速取出腎臟并固定。脫蠟:按常規(guī)方法進行脫蠟及水合(例:二甲苯脫蠟2次，5 min/次;乙醇水合(100%、95%、90%、80%、70%)。PBS浸泡5分鐘，洗滌3次。微波修復:將切片置于枸櫞酸三鈉∶枸櫞酸=3∶4配成的溶液中，微波中高火8分鐘。冷卻后，PBS浸泡5分鐘，洗滌3次。封閉滅活酶:3%H2O2-甲醇溶液處理切片15分鐘。PBS浸泡5分鐘，洗滌3次。加熒光標記二抗:FITC-羊抗小鼠 IgA(1∶500)100 μl，F(xiàn)ITC-羊抗小鼠 IgG(1∶200)100μl，37℃，孵育1小時。PBS浸泡5分鐘，洗滌3次。DAPI染色:甲醇∶DAPI原液 =19∶1，配成 DAPI染液工作液，加100μl，室溫避光10分鐘。PBS浸泡5分鐘，洗滌3次。封片:用防熒光淬滅的封片劑封片。熒光顯微鏡觀察拍照進行免疫熒光檢測(綠色熒光為細胞內(nèi)FITC的陽性標記;藍色為DAPI染色的細胞核結(jié)構(gòu))。

1．7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS15．0統(tǒng)計軟件分析。計量資料用±s表示，組間比較采用 F檢驗及Dunnett-t檢驗進行統(tǒng)計學處理。

2 結(jié)果

2．1 對二甲苯所致小鼠耳腫脹實驗 阿司匹林和LCQG大劑量組可對抗二甲苯所致小鼠耳腫脹，與模型組比較有顯著性差異(P＜0．05)，說明LCQG對二甲苯所致耳腫脹有一定抗炎作用。見表1。

2．2 對MRL/lpr狼瘡鼠尿蛋白、IgG、ds-DNA抗體的影響 中藥組(LCQG)、西藥組(Predinisone)、中藥+西藥組(LCQG+Predinisone)的血清抗dsDNA抗體、IgG和尿蛋白水平均顯著低于模型組(P＜0.05)，其中LCQG+Predinisone的血清IgG和抗ds-DNA抗體水平低于中藥組。見表2。

表1 LCQG對二甲苯致ICR小鼠耳腫脹的抗炎作用(n=10，±s)Tab．1 Effect of anti-inflammatory on ear-swelling inducedby xylene in ICR mice(n=10，±s)

表1 LCQG對二甲苯致ICR小鼠耳腫脹的抗炎作用(n=10，±s)Tab．1 Effect of anti-inflammatory on ear-swelling inducedby xylene in ICR mice(n=10，±s)

Note:Compared with model group，1)P ＜0．05，2)P ＜0．01．

Groups Dose(g/kg)Ear-swelling(mg)Inhibitory rate(%)----32．98 19．15 26．60 27．13 Model Aspirin LCQG(L)LCQG(M)LCQG(H)--0．6 11．4 22．8 45．6 0．018 8 ±0．005 8 0．012 6 ±0．003 62)0．015 2 ±0．004 2 0．013 8 ±0．005 2 0．013 7 ±0．003 51)

表2 LCQG對MRL/lpr狼瘡鼠血清IgG、dsDNA抗體水平及尿蛋白含量的影響(n=8，±s)Tab．2 Influence of LCQG in serum content of IgG anti-dsDNA antibody and urinary protein in MRL/lpr lupusmice(n=8，±s)

表2 LCQG對MRL/lpr狼瘡鼠血清IgG、dsDNA抗體水平及尿蛋白含量的影響(n=8，±s)Tab．2 Influence of LCQG in serum content of IgG anti-dsDNA antibody and urinary protein in MRL/lpr lupusmice(n=8，±s)

Note:Compared with model group，1)P ＜0．05，2)P ＜0．01．

Groups Dose(g/kg) IgG(μg/ml) anti-dsDNA antibody(pg/ml) Urinary protein(μg/ml)937．8 ±80．55 LCQG 45．6 20．05 ±2．751) 325．14 ±41．321) 677．6 ±167．921)Predinisone 0．01 19．34 ±3．231) 290．47 ±44．541) 629．2 ±173．061)LCQG+Predinisone 45．6+0．01 16．74 ±2．351) 285．07 ±31．082) 607．6 ±85．852)Model — 33．80 ±9．62 468．24 ±87．521)

圖1 LCQG對狼瘡鼠腎組織IgG沉積的影響(IF，×400)Fig．1 Influence of deposition of IgG in renal tissue in lupusmice(IF，×400)

圖2 LCQG對狼瘡鼠腎組織IgA沉積的影響(IF，×400)Fig．2 Influence of deposition of IgA in renal tissue in lupusmice(IF，×400)

表3 腎組織免疫熒光IgA、IgG檢測結(jié)果±s)Tab．3 Detection results of IgG and IgA in renal tissue by immunofluoresscence±s)

表3 腎組織免疫熒光IgA、IgG檢測結(jié)果±s)Tab．3 Detection results of IgG and IgA in renal tissue by immunofluoresscence±s)

Note:Compared with model group，1)P ＜0．05，2)P ＜0．01．

Groups Dose(g/kg)Percentage of IgA positive area(%)Percentage of IgG positive area(%)47．98 ±4．896 42．70 ±8．291 LCQG 45．6 34．62 ±5．9051) 27．88 ±2．7291)Predinisone 0．01 31．21 ±6．0231) 25．63 ±4．5261)LCQG+Predinisone 45．6+0．01 25．64 ±7．2862) 23．61 ±3．2292)Model —

2．3 對狼瘡性MRL/lpr小鼠腎臟熒光免疫組化的影響 熒光顯微鏡下可見，模型組 IgG、IgA均呈強陽性，熒光陽性面積范圍較大。中藥組(LCQG)、西藥組(Predinisone)IgG、IgA熒光強度較弱，熒光陽性面積顯著減少(P ＜0．05)，中藥 +西藥(LCQG+Predinisone)組熒光強度呈微弱陽性，IgG、IgA熒光面積顯著減少(P ＜0．01)。見圖1、2，表3。

3 討論

SLE的發(fā)病原因目前尚不完全清楚，臨床以廣泛組織和多器官損傷及病情進行性加重為主要特點，預后較差，有約10%的患者在發(fā)病5年內(nèi)死亡［1，2］。其發(fā)病機理一般認為:由于機體免疫系統(tǒng)中主要的調(diào)節(jié)性及效應性細胞出現(xiàn)功能異常，即T淋巴細胞亞群比例，體內(nèi)Th1/Th2細胞之間比例失衡，自身反應性T細胞增殖，導致B細胞功能亢進產(chǎn)生大量自身抗體，體內(nèi)抗原和抗體結(jié)合形成免疫復合物沉積于臟器，損傷細胞膜，從而出現(xiàn)SLE的各種臨床癥狀［3-5］。SLE是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為典型的自身免疫性疾病。

SLE的治療原則為消除炎癥的抗炎療法和糾正病理過程。本研究的結(jié)果顯示:狼瘡清顆粒可以抑制二甲苯導致的小鼠耳腫脹，抗炎作用明確，同時由于SLE患者體內(nèi)存在著免疫功能的紊亂，大量自身抗體的產(chǎn)生，血清中免疫球蛋白含量的明顯升高。本實驗選用MRL/lpr狼瘡鼠作為動物模型，此鼠由LG/J、AKR/J、C3H/D 及 C57BL/6 等不同品系小鼠交配至第12代時產(chǎn)生，以顯著的淋巴腺病、脾腫大、大量抗DNA抗體和腎炎為特征。MRL/lpr的lpr基因被認為是引起SLE的主要基因。這些突變鼠10～12周齡開始出現(xiàn)病理變化，在4個月后同時發(fā)生進行性的腎臟損害，系統(tǒng)性血管炎，關(guān)節(jié)、唾液腺、肺和皮膚的炎癥［6，7］。檢測 MRL/lpr SLE鼠血清中IgG、抗dsDNA抗體水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn):模型組IgG、抗dsDNA水平明顯較高，中藥組、西藥組、中藥+西藥組能降低模型組小鼠血清IgG、抗dsDNA水平，中西藥結(jié)合治療效果更明顯?？筪s-DNA抗體是SLE的血清學標志物，也是評估病情活動性和預后的重要指標［8，9］?？筪s-DNA抗體等循環(huán)抗體特異地結(jié)合在核小體或組蛋白上，或者特異地結(jié)合在核小體或組蛋白的免疫復合物上，在腎小球基底膜形成新的免疫復合物，引起或加重狼瘡性腎炎［10］。蛋白尿是狼瘡腎炎的臨床特征之一，持續(xù)大量蛋白尿是預后差的一個標志，且與腎小球硬化程度相關(guān)［11］。結(jié)果顯示中藥、西藥組、中西藥結(jié)合治療均能降低尿蛋白，中西藥結(jié)合治療效果更顯著。同時狼瘡腎炎的形成主要是由于腎小球系膜及基底膜多種免疫復合物及補體沉積造成的，經(jīng)腎組織免疫熒光檢測時呈陽性，這被認為是狼瘡腎炎最有特征性的病理改變［12］。我們的研究表明，中藥組、中藥+西藥組在適宜的劑量下能抑制多種免疫球蛋白(IgG，IgA)在腎臟的沉積，明顯改善MRL/lpr SLE小鼠腎組織的病理損害，故中西藥結(jié)合治療效果更好。

方中水牛角為君藥，具有清熱解毒、涼血的作用。臣藥白花蛇舌草加強其清熱解毒之力;赤芍、丹皮助其涼血散瘀;生地一以清熱涼血，一以養(yǎng)陰生津，顧護陰液。佐藥炙僵蠶、秦艽、青風藤活血通絡止痛，制黃精、炒白術(shù)、陳皮具有益氣健脾燥濕、理氣和胃的功能，以顧護中焦脾胃。本方諸藥配伍具有清熱解毒、涼血化瘀、滋養(yǎng)陰液、扶正祛邪的功效［13-15］。因而在臨床上既能提高西醫(yī)的治療效果，又能減少糖皮質(zhì)激素的用量、副作用、縮短病程。對其如何發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的機制還有待于進一步的研究。

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