可溶性Fas表達水平與人黑色素瘤相關性的初步研究①

譚 巖 王永晨 白 曉 蘆小單 方艷秋 (吉林省人民醫院醫學診治實驗中心，長春 130021)

黑色素細胞癌(Malignantmelanoma)是由黑色素細胞惡性轉化而形成的，具有高侵襲、高轉移的特性。惡性黑色素瘤因其持續增長的發病率和死亡率日益受到人們的重視，其發病率在近二十年中成倍增長［1］。據統計，惡性黑色素瘤發病率占全部惡性腫瘤的3%，占皮膚惡性腫瘤的7% ～20%，其發病率年平均增長速度為4% ～6%［2］。惡性黑色素瘤可由先天性良性黑色素細胞痣演變而成，或是由發育不良性痣惡變而來，也可以是新發生的，而由藍痣或其他皮膚樹突狀細胞吞噬小節演變而成的極為罕見［3］。Fas是腫瘤壞死因子受體家族的成員，又稱為Apo-1/CD95，是Ⅰ型跨膜受體蛋白。細胞膜上表達的Fas與其配體FasL作用，傳遞細胞凋亡信號。Fas/FasL在腫瘤中的作用機制被重視和廣泛研究。可溶性Fas(soluble Fas，sFas)是缺少Fas跨膜結構域的一種剪接體，也因此能夠分泌到循環系統中。有研究者認為，sFas分子能夠抑制功能性Fas/FasL復合物形成［4］。目前對于sFas在惡性腫瘤中的表達報道不一，但多數研究提示在惡性腫瘤中sFas均有不同程度的增高［5］。本研究對黑色素細胞癌患者的臨床資料進行了回顧性分析，通過ELISA方法對黑色素瘤患者血清sFas水平進行比較，探討了sFas在惡性黑色素細胞癌中過量表達的意義。

1 材料與方法

1．1 臨床資料

1．1．1 免疫熒光實驗用臨床標本 吉林省人民醫院、哈爾濱醫科大學附屬第一醫院(2001～2008年)資料保存完整并經臨床病理證實為黑色素瘤患者的石蠟包埋組織。根據WHO病理分類標準，將標本分為4組:MM伴淋巴結轉移組(A組)、MM無轉移組(B組)、良性黑色素細胞痣組(C組)和良性黑色素細胞痣旁正常組織對照組(D組);各組例數分別為:A組16例、B組19例、C組2l例、D組28例，共84例，其中男性43例，女性41例，年齡25～70歲，平均52．3歲。所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4μn厚連續切片，備免疫組化染色。本研究經醫院倫理道德委員會批準，用于實驗的全部樣本均取得知情同意。

1．1．2 sFas檢測用臨床標本 病例資料來源于吉林省人民醫院、哈爾濱醫科大學附屬第一醫院(2001～2008年)，經臨床病理證實為黑色素瘤的患者。用于檢測sFas的樣品中，隨機選擇9例經臨床病理證實為MM患者的血清樣本，其中男性3例，女性6例，年齡26～75歲，平均57．89歲，所有患者手術前均未應用放療、化療或免疫制劑;隨機選擇6例黑色素細胞痣患者的血清樣本，其中男性3例，女性3例，年齡23～72歲，平均50．17歲;隨機選擇6例正常健康人血清樣本，其中男性4例，女性2例，年齡26～69歲，平均42．7歲。所有樣本均抽取肘靜脈血2 ml于EDTA的抗凝塑料管中，以1 500 r/min離心20分鐘，分離出血清后存儲于－80℃冰箱中待測。

1．2 試劑 免疫熒光反應使用鼠抗人Fas單克隆抗體、兔抗人FasL單克隆抗體(Santa Cruz)，羊抗兔IgG-FITC、羊抗鼠 IgG-Cy3、Hoechst 33342(Sigma)。ELISA實驗使用人sFas ELISA檢測試劑盒(Sigma)。

1．3 方法

1．3．1 免疫熒光實驗 石蠟切片機切片4μm，70℃烤箱烤片2小時;切片脫蠟;入1% 火棉膠溶液4℃ 15分鐘，梯度酒精至水，覆蓋液處理4℃ 10分鐘，0．1%PBS緩沖液中放置4℃ 1小時;蛋白酶消化5～30分鐘;0．1%PBS緩沖液洗5分鐘×3次;非免疫血清覆蓋30分鐘;標記一抗4℃過夜;0.1%PBS緩沖液洗5分鐘×3次;熒光二抗30分鐘，避光;甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。Fas陽性顯現紅色熒光，FasL陽性顯現綠色熒光，細胞核顯現藍色熒光。

1．3．2 ELISA實驗 用抗人 sFAS/APO-1抗體包被酶標板上，標準品和樣品中的sFas與單抗結合，加入生物素化的抗人sFas抗體，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入酶底物OPD，出現黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492 nm處測OD值，sFas濃度與OD值呈正比，可通過繪制標準曲線求出標本中sFas的濃度。具體實驗步驟:將試劑盒平衡至室溫;建立標準曲線:設標準孔8個，每孔加入樣品稀釋液100μl，第一孔加入標準品100μl，混勻后用加樣器吸出100μl移至第二孔，如此反復對倍稀釋至第7孔，第8孔為空白;加樣:每孔加入100μl待測血清;反應板置37℃反應120分鐘;洗板:用洗滌液反復洗滌4～6次;每孔加入第一抗體工作液50μl;將反應板混勻后置37℃ 60分鐘，洗板;每孔加入酶標抗體工作液100μl;將反應板混勻后置37℃ 60分鐘，洗板;每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗處反應5～10分鐘;每孔加入50μl終止液;在492 nm處測吸光值。以標準品的OD值在Excel中制出半對數曲線，將標準品濃度設為X軸，OD值為Y軸，將樣品的OD值帶入公式，計算濃度，比較正常組、黑色素痣組和惡性黑色素瘤組組間差異。

1．4 統計學處理 采用GraphPad Prism 5軟件進行統計處理。計量資料數據以±s表示，兩組間參數比較采用t檢驗分析或雙向變異數分析(Two-way ANOVA)。

2 結果

2．1 黑色素細胞癌組織的病理分析 經組織病理分析，35例為黑色素瘤組織，病理分型:淺表型(Superficial spreading melanoma，SSM)2 例、結節型(Nodularmelanoma，NM)9例、肢端型(Acral lentiginousmelanoma，ALM)18例、雀斑痣型(Lentigo malignamelanoma，LMM)6例。腫瘤浸潤深度≥0.5 mm占 85．7%(32/35)。伴有淋巴結轉移的占45.7%(16/35)。Clark分級Ⅰ級3例，Ⅱ級5例，Ⅲ級5例，Ⅳ級12例，Ⅴ級10例。臨床分期1期8例、2期6例、3期9例、4期12例。

2．2 Fas/FasL表達水平差異比較 用免疫熒光方法對正常皮膚組織，良性黑色素痣組織和黑色素細胞癌組織中，分析 Fas/FasL表達水平，結果以免疫熒光強度的形式進行比較，見表1。在正常皮膚組織中，Fas熒光強度為581．25 ±164．58，FasL 熒光強度為5．62 ±4．88;在良性黑色素痣組織中，Fas熒光強度為410．52 ±239．24，FasL 熒光強度為 88．09 ±86．28;在惡性黑色素細胞癌組織中，Fas熒光強度為119．01 ±117．65，FasL 熒光強度為 438．77 ±321.33。比較各組Fas表達熒光強度差別具有統計學意義(P＜0．001)，組間兩兩比較差別具有統計學意義(P＜0．05)，在正常組織中Fas熒光強度最高，其次為黑色素細胞痣組，惡性黑色素癌組Fas熒光強度最低;比較各組FasL表達熒光強度有統計學意義(P＜0．001)，組間兩兩比較，正常組和黑色素細胞痣組無統計學意義(P＞0．05)，其余各組兩兩比較有統計學意義(P＜0．05)，FasL熒光強度在惡性黑色素瘤組中最高，其次是黑色素細胞痣組和正常組織。

表1 不同組織Fas/FasL免疫熒光強度(±s)Tab．1 Flourescence value of Fas/FasL in different type of tissues(±s)

表1 不同組織Fas/FasL免疫熒光強度(±s)Tab．1 Flourescence value of Fas/FasL in different type of tissues(±s)

Flourescence value Groups 581．25 ±164．58 5．62 ±4．88 Melanocytic nevus(n=21) 410．52 ±239．24 88．09 ±86．28 Malignantmelanoma(n=35)Fas FasL Control(n=28)119．01 ±117．65 438．77 ±321．33

圖1 不同組織Fas/FasL免疫熒光強度差異比較Fig．1 Compare of Fas/FasL expression by immunoflourescence

經過雙向變異數分析方法(Two-way ANOVA)進行組間比較，發現各組織中免疫熒光Fas與FasL熒光強度具有顯著性差異(P＜0．001)，見圖1。

圖2 血清中可溶性sFas表達水平在正常人、良性黑色素痣、惡性黑色素癌患者中的差異Fig．2 Serum soluble Fas expression levels of control，MN and MM

2．3 可溶性sFas在惡性黑色素癌患者體內表達較高 檢測惡性黑色素瘤患者及黑色素痣和正常人血清sFas水平，結果顯示:正常組sFas濃度為4．18±1．88 ng/ml(n=6)，黑色素痣組 sFas濃度為 7．33 ±3．78 ng/ml(n=6)，惡性黑色素瘤組 sFas濃度為36．32 ±11．57 ng/ml(n=9)，各組數據之間差異有顯著統計學意義(P＜0．001)，組間兩兩比較顯示正常對照組和黑色素痣組之間的差別無統計學意義(P＞0．05)，惡性黑色素瘤組和其他兩組之間比較的差異均有顯著統計學意義(P＜0．001)，各組中惡性黑色素瘤組血清sFas水平最高(圖2)。

3 討論

Fas/FasL系統在人體適當表達對維持機體自身平衡發揮著極其重要的作用，但如果Fas/FasL系統調節失調，則會給人體帶來損害，引起組織增生惡變或組織間相互致死。近幾年來，對Fas/FasL系統介導細胞凋亡與腫瘤免疫逃避的研究取得了很大的研究進展，提出了Fas/FasL系統介導細胞凋亡障礙是腫瘤形成的重要原因。從對Fas和FasL的分離、鑒定、表達及功能等的研究中發現，Fas/FasL系統在人體細胞凋亡、免疫逃避及維持機體的穩態平衡上有重要生理功能，并證明Fas/FasL系統的功能性損傷和惡性黑色素瘤的發生、發展相關［6］。本研究通過免疫熒光的方法對惡性黑色素癌組織、黑色素痣組織和正常皮膚組織中Fas、FasL表達情況進行了分析，發現Fas在正常皮膚組織中高表達，惡性黑色素癌組織中低表達;與之相反，FasL在惡性黑色素癌組織中高表達，在正常皮膚組織中低表達，說明人體中Fas/FasL的變化與惡性黑色素瘤的發生和發展具有相關性。

sFas可以從細胞膜分泌或脫落到細胞外釋放入血液循環，所以可以在血漿中被檢測出來。有研究表明，無論是造血系統腫瘤還是非造血系統腫瘤，越來越多的腫瘤病人血清中sFas水平升高，提示sFas可能作為一個保護因子來幫助腫瘤細胞在宿主的微環境中逃避凋亡［7-9］。Li等［10］報道了實體惡性腫瘤血清sFas也有升高，推測sFas有望成為反映疾病狀態、腫瘤負荷的候選指標。Jodo等［5］的研究顯示，若sFas以3．03μg/L為臨界水平，則正常組sFas陽性率為 1．7%，肝硬化組為 25．9%，肝癌組為59.0%，且多發性病灶的肝癌病人血清中sFas水平明顯高于單發性的病人。研究者對膀胱癌的研究顯示，病人組的sFas水平明顯高于正常對照組，而且在隨后5年的隨訪中，sFas高水平組的生存率明顯低于低水平組，多因素分析顯示高水平sFas是影響預后的獨立的危險因子。其他實驗室陸續發現，sFas在乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中也有相似變化，且均與病情變化及預后有密切聯系［9］。

本研究通過比較sFas在惡性黑色素瘤、良性黑色素痣和正常人血清中的表達水平，發現正常組和良性黑色素痣組的sFas濃度明顯低于惡性黑色素瘤組sFas濃度，各組中惡性黑色素瘤組血清sFas含量最高。本研究認為，血清sFas水平異常增高與惡性黑色素瘤的惡性行為有關，推測血清sFas水平對惡性黑色素瘤可能具有診斷價值，其可能機制為:雖然在惡黑中FasL表達量增加，似乎更有利于Fas與FasL結合，但一方面此時Fas表達量較少不利于二者很好結合，另一方面，在惡黑中sFas表達增加，使sFas與原本表達量就不多的Fas相互競爭，與FasL結合，從而阻斷了Fas/FasL系統介導的細胞凋亡途徑，使腫瘤細胞增殖，惡性程度增加。因此，研究惡性黑色素瘤患者sFas水平，來判斷惡性黑色素瘤患者的預后及腫瘤的進展和轉移情況，以探討其在惡性黑色素瘤發生、發展中的作用及其在術前或早期診斷的意義，將為惡性黑色素瘤診斷和治療提供更有力的依據［11-13］。

1 Zhang Q，Wu J，Nguyen A et al．Molecular mechanism underlying differential apoptosis between human melanoma cell lines UACC903 and UACC903(+6)revealed by mitochondria-focused cDNA microarrays［J］．Apoptosis，2008;13(8):993-1004．

2 Bogenrieder T，Herlyn M．Themolecular pathology of cutaneousmelanoma［J］．Cancer Biomark，2010;9(1-6):267-286．

3 Eggermont A M，Robert C．Melanoma in 2011:a new paradigm tumor for drug development［J］．Nat Rev Clin Oncol，2011;9(2):74-76．

4 Hanahan D，Weinberg R A．Hallmarksof cancer:the nextgeneration［J］．Cell，2011;144(5):646-674．

5 Jodo S，Kobayashi S，Nakajima Y etal．Elevated serum levelsof soluble Fas/APO-1(CD95)in patients with hepatocellular carcinoma［J］．Clin Exp Immunol，1998;112(2):166-171．

6 Anastassiou G，Coupland SE，Stang A et al．Expression of Fas and Fas ligand in uvealmelanoma:biological implication and prognostic value［J］．JPathol，2001;194(4):466-472．

7 Balch CM，Soong S J，Gershenwald JE et al．Prognostic factors analysisof17，600melanoma patients:validation of the American Joint Committee on Cancermelanoma staging system ［J］．JClin Oncol，2001;19(16):3622-3634．

8 Matsuki Y，Li L，Hsu H C etal．Soluble Fasgene therapy protectsagainst Fas-mediated apoptosis of hepatocytes but not the lethal effects of Fas-induced TNF-alpha production by Kupffer cells［J］．Cell Death Differ，2002;9(6):626-635．

9 Eberle J，Fecker L F，Hossini AM et al．CD95/Fas signaling in human melanoma cells:conditional expression of CD95L/FasL overcomes the intrinsic apoptosis resistance ofmalignantmelanoma and inhibits growth and progression of human melanoma xenotransplants［J］．Oncogene，2003;22(57):9131-1941．

10 Li C，Larson D，Zhang Z et al．Polymorphisms of the FASand FAS ligand genes associated with risk of cutaneousmalignantmelanoma［J］．Pharmacogenet Genomics，2006;16(4):253-263．

11 Li L H，Wu L J，Jiang Y Y et al．Silymarin enhanced cytotoxic effect of anti-Fas agonistic antibody CH11 on A375-S2 cells［J］．J Asian Nat Prod Res，2007;9(6-8):593-602．

12 王永晨，譚 巖．Fas/FasL及增殖細胞核抗原表達與人黑素瘤惡性程度［J］．中華醫學雜志，2008;88(14):965-968．

13 劉 靜，王永晨．惡性黑色素瘤患者血清可溶性Fas水平變化及臨床意義［J］．中華全科醫師雜志，2009;8(8):570-571．