氣管炎丸治療慢性支氣管炎作用機(jī)制的研究

黃紅坤 黃小紅 劉盛來(lái) 黃小瓊 嚴(yán)家榮 王 諾 趙偉健 王 剛*

（廣東省佛山市醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 佛山 528248）

氣管炎丸治療慢性支氣管炎作用機(jī)制的研究

黃紅坤 黃小紅 劉盛來(lái) 黃小瓊 嚴(yán)家榮 王 諾 趙偉健 王 剛*

（廣東省佛山市醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 佛山 528248）

目的探討氣管炎丸治療煙熏引起慢性支氣管炎模型大鼠的作用機(jī)制。方法通過(guò)煙熏法復(fù)制慢性支氣管炎大鼠模型，SD大鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及氣管炎丸組。正常對(duì)照組不作任何處理，模型對(duì)照組和氣管炎丸組通過(guò)煙熏造模，模型對(duì)照組給予生理鹽水、氣管炎丸組給予氣管炎丸進(jìn)行干預(yù)，觀察氣管炎丸對(duì)大鼠血清CRP、sICAM-1及肺組織IL-8、NO等指標(biāo)的影響。結(jié)果氣管炎丸組與模型對(duì)照組比較，肺組織IL-8顯著性升高（P＜0.01）、NO顯著性降低（P＜0.05）。血清CRP、sICAM-1均降低，但差異無(wú)顯著性。結(jié)論降低肺組織IL-8、提高肺組織NO含量可能是氣管炎丸發(fā)揮治療慢性支氣管炎重要作用機(jī)制之一。

氣管炎丸；慢性支氣管炎；白介素-8（IL-8）；一氧化氮（NO）

慢性支氣管炎是一種常見(jiàn)的慢性非特異性呼吸系統(tǒng)疾病，其防治一直是中醫(yī)藥界研究的課題之一[1]。氣管炎丸是由麻黃、杏仁、石膏、甘草、黃芩等組成的復(fù)方制劑，具有散寒鎮(zhèn)咳，祛痰定喘的功效，主要用于外感風(fēng)寒引起的咳嗽，氣促哮喘，喉中發(fā)癢，痰涎壅盛，胸膈滿悶，老年痰喘。本文以煙熏法建立大鼠慢性支氣管炎模型[2,3]，通過(guò)給予氣管炎丸治療后觀察模型大鼠血清中C反應(yīng)蛋白（CRP）、細(xì)胞間粘附分子-1（sICAM-1）含量變化，肺組織勻漿上清液中白介素8（IL-8）、一氧化氮（NO）含量的變化，肺組織HE染色后光鏡下觀察支氣管與肺組織的形態(tài)變化，綜合探討該藥治療慢性支氣管炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠45只，雌24只、雄21只，體質(zhì)量180～220g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（粵）2008-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)：0060682。動(dòng)物飼養(yǎng)在本中心屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)，飼養(yǎng)溫度與濕度：20～26℃，40%～70%，其他環(huán)境指標(biāo)均保持穩(wěn)定。飼料為鼠用配合飼料（合格證號(hào)：0078172），飲用滅菌水。動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

氣管炎丸，北京同仁堂制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：3082590。用時(shí)用蒸餾水配制成0.46g/mL溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

黃煙葉，自制成8g/根煙卷。NO測(cè)定試劑盒：南京建成科技有限公司，批號(hào)：20100417。主要試劑：CRP試劑盒，批號(hào)：C030132； sICAM-1試劑盒，批號(hào)：C0301109； IL-8試劑盒，批號(hào)：C03115；均為CUSABIO BIOTECH CO.,LTD產(chǎn)品。NO試劑盒，批號(hào)：20100424，南京建成科技有限公司提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

生物顯微鏡，日本OLYMPUS，型號(hào)：CK21；電子分析天平，梅特勒-托利多公司，型號(hào)：PB203-N。UV2800紫外分光光度計(jì)：上海尤尼卡儀器有限公司；BS-3000A電子天平：上海友聲衡器有限公司。全自動(dòng)酶標(biāo)儀，型號(hào)：ELX800，美國(guó)BIO-TEX生產(chǎn)。RM2135輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國(guó)LEICA公司。TS-12C生物組織全自動(dòng)脫水機(jī)，湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司。BM-VII生物組織包埋機(jī)及冷凍機(jī)，湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司。CS-VI攤片烤片機(jī)，湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司。RS-18生物組織全自動(dòng)染色機(jī)，湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司。BX41病理圖像分析系統(tǒng)，日本奧林巴斯。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

吸煙造模：SPF級(jí)SD大鼠45只，180-220g，雌24只、雄21只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組12只（雌雄各半）和模型組33只（雌18只雄15只）。將模型組大鼠分批（雌雄分開(kāi)）置于特制的50cm×50cm× 40cm的煙室中，每次用煙葉8g，點(diǎn)燃熏煙，2次/d，每次50min，持續(xù)40d。同時(shí)在造模第30天時(shí)，取造模大鼠3只（雌2只雄1只），頸椎脫臼處死，取右肺中葉置10%中性甲醛固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)，了解造模情況。正常對(duì)照組12只大鼠置于特制的50cm×50cm×40cm的煙室中（無(wú)須煙熏），2次/d，每次50min，持續(xù)40d。

給藥治療：造模40天后將模型組30只SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型對(duì)照組、氣管炎丸組，劑量4.6g（/kg·d），每組15只（雌8只雄7只）；正常對(duì)照組仍為造模前分組的12只（雌雄各半）。每天氣管炎丸組大鼠按4.6g.kg-1.d-1劑量灌胃給予氣管炎丸藥液，模型對(duì)照組給予等量的蒸餾水，連續(xù)灌胃20d。同時(shí)，模型對(duì)照組和氣管炎丸于每天灌胃后，將大鼠分組（雌雄分開(kāi)）置于特制的50cm×50cm×40cm的煙室中，每次用煙葉8g，點(diǎn)燃熏煙，2次/d，每次50min，持續(xù)煙熏20d。正常對(duì)照組12只大鼠不給藥，雌雄分開(kāi)置于特制的50cm×50cm ×40cm的煙室中（無(wú)須煙熏），2次/d，每次50min，持續(xù)20d。

表1 氣管炎丸對(duì)慢性支氣管炎模型大鼠血清CRP、sICAM-1和勻漿上清液IL-8、NO的影響（χ—±s）

表2 氣管炎丸對(duì)慢性支氣管炎大鼠氣管肺組織形態(tài)學(xué)改變的影響

檢測(cè)指標(biāo)：末次給藥24h，各組大鼠戊巴比妥鈉麻醉腹主靜脈采血，分離血清，測(cè)定血清中C反應(yīng)蛋白（CRP）、細(xì)胞間粘附分子-1（sICAM-1）含量變化。腹主動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，取左肺組織：一份為左肺中部0.5cm×0.5cm組織甲醛固定待組織病理學(xué)HE染色后鏡檢（每組取8例檢測(cè)，雌雄各半）；另一份制備肺組織勻漿、離心、提取上清液；測(cè)定肺組織勻漿上清液中白介素8（IL-8）、一氧化氮（NO）的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，血清CRP及sICAM-1，肺組織勻槳上清IL-8、NO等指標(biāo)采用單因素方差分析等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示（χ—±s），HE染色切片進(jìn)行病理半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察：造模期模型組大鼠煙熏期間出現(xiàn)咳嗽、流淚、靜臥不動(dòng)，煙熏結(jié)束后恢復(fù)活躍。給藥治療期模型對(duì)照組和氣管炎丸組大鼠均偶有咳嗽現(xiàn)象，模型對(duì)照組大鼠較嚴(yán)重。

2.2 血清CRP、sICAM-1：模型對(duì)照組大鼠血清CRP、sICAM-1與正常對(duì)照組比較顯著性升高（P＜0.01）。氣管炎丸組大鼠血清CRP、sICAM-1較模型對(duì)照組均降低，但與模型對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 肺組織勻漿上清IL-8、NO含量：模型對(duì)照組大鼠肺組織勻漿上清IL-8含量與正常對(duì)照組比較顯著性升高（P＜0.01），NO含量與正常對(duì)照組比較顯著性降低（P＜0.05）。與模型對(duì)照組比較，氣管炎丸組IL-8顯著性降低（P＜0.01）、NO含量顯著性上升（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 肺組織HE染色病理學(xué)觀察

正常對(duì)照組大鼠鏡下見(jiàn)細(xì)、小支氣管管腔規(guī)則、圓形，氣管黏膜上皮為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，黏膜上皮完整，纖毛未見(jiàn)粘連及脫落，管壁未見(jiàn)增厚，管腔內(nèi)未見(jiàn)滲出物，肺泡腔未見(jiàn)病理性擴(kuò)大（圖1）。模型對(duì)照組大鼠肺組織鏡下見(jiàn)細(xì)、小支氣管黏膜增厚，皺襞增多，纖毛不整，部分纖毛消失，杯狀細(xì)胞局灶顯著增多，支氣管黏膜上皮部分脫落，支氣管周不同程度炎細(xì)胞浸潤(rùn)（多為淋巴細(xì)胞），部分支氣管管壁平滑肌增厚明顯，肺泡間隔不同程度增厚、間隔中淋巴細(xì)胞增多，肺泡壁毛細(xì)血管充血、小血管充血。支氣管周炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚。結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)煙熏制作慢性支氣管炎大鼠模型成功。（圖2）。氣管炎丸組大鼠鏡下見(jiàn)細(xì)、小支氣管黏膜皺襞輕度增多，纖毛不整，肺泡腔大小較一致，部分肺泡間隔菲薄，部分肺泡間隔呈不同程度增厚，肺泡壁毛細(xì)血管充血、小血管充血（圖3）。氣管炎丸能改善慢性支氣管炎大鼠支氣管黏膜病變程度。

圖1 正常對(duì)照組（H.E×100）

圖2 模型對(duì)照組（H.E×200）

圖3 氣管炎丸對(duì)照組（H.E×100）

模型對(duì)照組大鼠支氣管黏膜病變、支氣管管壁病變、基底部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與正常對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05）。氣管炎丸組大鼠的支氣管黏膜病變程度與模型對(duì)照組比較均具有顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用改良煙熏法制備慢性支氣管炎模型大鼠，制備過(guò)程中以咳嗽癥狀為主，肺組織鏡下見(jiàn)細(xì)、小支氣管黏膜增厚，皺襞增多，纖毛不整，部分纖毛消失，杯狀細(xì)胞局灶顯著增多，支氣管黏膜上皮部分脫落，支氣管周不同程度炎細(xì)胞浸潤(rùn)（多為淋巴細(xì)胞），部分支氣管管壁平滑肌增厚明顯，肺泡間隔不同程度增厚、間隔中淋巴細(xì)胞增多，肺泡壁毛細(xì)血管充血、小血管充血。支氣管周炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚。結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)煙熏制作慢性支氣管炎大鼠模型成功。

慢性支氣管炎病理發(fā)生過(guò)程中受多種因子的影響。CRP是一種時(shí)相蛋白，在炎癥或肺組織急性損傷時(shí)合成增加，并具有迅速合成迅速降解的特性，較多用于炎癥急性期。對(duì)于慢性支氣管炎，有時(shí)即使出現(xiàn)炎癥癥狀并不一定出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)[4]。在煙霧致慢性支氣管炎形成過(guò)程中，煙霧刺激可激活巨噬細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子和趨化因子如IL-8、TNF-α，可引起sICAM-1表達(dá)增加，介導(dǎo)黏膜炎癥和免疫反應(yīng)。NO是巨噬細(xì)胞分泌的具有多種生物活性的無(wú)機(jī)自由基，一方面NO是巨噬細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的重要物質(zhì)之一，可能引起或加重組織損傷，但另一方面，NO具有舒張血管、干擾細(xì)胞氣化還原狀態(tài)，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)而有利于肺組織重建的作用[5]。NO含量變化在一定程度上反映巨噬細(xì)胞的功能變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氣管炎丸干預(yù)后，模型大鼠血清CRP、sICAM-1均降低，但無(wú)顯著性差異，說(shuō)明該藥在影響慢性支氣管炎模型大鼠血清CRP、sICAM-1含量等方面作用敏感性較低，而對(duì)減少肺組織IL-8的含量和提高NO的含量方面的作用敏感性較高。綜合上述，在本實(shí)驗(yàn)條件下氣管炎丸主要是通過(guò)減少肺組織IL-8的含量、使肺組織中NO產(chǎn)生增加，提高肺組織的抗氧化損傷能力而減少慢性支氣管炎癥的損傷，改善大鼠支氣管黏膜病變等方面發(fā)揮治療慢性支氣管炎模型大鼠的作用。

[1] 劉士生,吳秀艷,秦愛(ài)東.中醫(yī)藥治療慢性支氣管炎研究進(jìn)展[J].唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,7(1)∶56-58.

[2] 陳奇.中藥藥效研究思路與方法[M].北京∶人民衛(wèi)生出版社,2005.

[3] 李慶云,黃紹光,吳華成.大鼠吸煙致慢性支氣管炎模型氣道炎癥研究[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,24(1)∶31-35.

[4] 金怡,蔣兆華,超波.C-反應(yīng)蛋白測(cè)定在慢性支氣管炎治療效果中的應(yīng)用[J].中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2008,11(11)∶1712.

[5] Tetly TD.Macrophages and pathogenesis of COPD[J].Chest,2002, 121(1)∶156-159.

Qiquanye Pill to the Study of the Mechanism of Chronic Bronchitis

HUANG Hong-kun, HUANG Xiao-hong, LIU Sheng-lai, HUANG Xiao-qiong, YAN Jia-rong, WANG Nuo, ZHAO Wei-jian, Wang Gang

(Guangdong Medical Laboratory Animal Center, Foshan 528248,China)

ObjectiveExplore the Qiguanye pill treatment of smoke caused by the mechanism of the rat model of chronic bronchitis.MethodsCopied by the smoke method a rat model of chronic bronchitis, experimental SD rats were divided into normal control group, model group and Qiguanye pill group. Normal without any treatment in the control group, model group and Qiguanye pill group through the smoke modeling, model control group were given saline, The Qiguanye pill group was given the Qiguanye pill intervention, observe Qiguanye pills rat serum CRP and soluble intercellular adhesion molecule -1 in lung tissueIL-8, the impact of NO and other indicators.ResultsQiguanye pill group compared with the model group, lung tissue IL-8 were significantly increased (P＜0.01) NO significantly decreased (P＜0.05). Serum CRP, sICAM-1 in lung tissue decreased, but the difference was not significant.ConclusionsReduce lung tissue IL-8, and improve the content of lung tissue NO may play an important role in one of the mechanisms of the treatment of chronic bronchitis Qiguanye pills.

Chronic bronchitis; Qiguanye pill; IL-8; NO

R562.2+1

B

1671-8194（2013）13-0048-03