不同預孵時間對ELISA抗－HIV和抗－HCV實驗結果的影響

羅保紅 劉振北 周仲民 劉峭梅

廣西壯族自治區血液中心，廣西 柳州 545005

使用BEPIII全自動酶免分析儀，能提高實驗室的工作效率和檢驗質量，減少由于人工操作所造成的誤差。但是，BEPIII在同時處理多塊酶標反應板實驗時，常出現“堵車”現象，從而使ELISA酶標反應板在預孵室 (室溫)中滯留了過長時間后才能正式進入孵育室 (37℃)。本文通過實驗，對滯留時間 (即預孵時間)的增加可能造成ELISA實驗結果受到的影響進行探討，結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 受檢標本

1.1.1 抗－HIV標本6份:第1份為陰性標本，用陰性獻血員的血清混合配成;第2份為弱陽性標本，用陰性獻血員的血清加入陽性標本配成;第3份為陽性標本，用陽性獻血員的血清混合配成;第4份為陰性對照，用抗－HIV試劑盒陰性對照混合配成;第5份為陽性對照，用抗－HIV試劑盒陽性對照混合配成;第6份為質控血清，用2NCU/ml稀釋成低OD值血清。第1～3份標本分別平行分裝到16支試管中，第4～6份則分別平行分裝到8支試管中。

1.1.2 抗－HCV標本6份:第1份為陰性標本 (×16);第2份為弱陽性標本 (×16);第3份為陽性標本 (×16);第4份為陰性對照 (×8);第5份為陽性對照 (×8);第6份為2NCU/ml質控血清 (×8)。其配制方法與抗－HIV標本類同。

1.2 儀器與試劑 RSP200全自動加樣器 (瑞士TECAN公司);BEPIII酶免分析儀 (德國德靈公司);抗－HIV和抗－HCV ELISA試劑盒 (北京萬泰藥業有限公司，批號分別是I20050404，C20050404);2NCU/ml抗 －HIV質控血清(衛生部臨檢中心);2NCU/ml抗－HCV質控血清 (上海血液中心)。

1.3 方法

1.3.1 取出試劑并放置在溫度23℃，濕度68%的實驗室平衡30分鐘。

1.3.2 為了減少板間差異，實驗時用同一批號，并且分拆同一板的包被條來檢測同一份標本和陰、陽性對照及質控血清。1.3.3 用同一臺RSP200把72個標本加到5塊ELISA抗－HIV酶標反應板中，置室溫中分別在 0、15、30、45、60min進入同一臺BEPIII進行檢測。

1.3.4 抗－HCV的檢測方法與抗－HIV相同。

1.4 統計學處理 使用SPSS 19.0統計軟件，測定結果用±s)表示，兩組間的比較采用t檢驗，P＜0.05為兩者差異顯著，P＜0.01為兩者差異非常顯著。

2 結果

2.1 ELISA抗 －HIV酶標反應板在室溫 (23℃)、濕度68%條件下，分別放置0、15、30、45、60min后進入BEPIII檢測。檢測結果經統計后比較顯示:①陰性標本15、45min結果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05。②弱陽性標本30、45、60min結果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;30、45、60min結果分別與15min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05。③陽性標本15、30、45、60min結果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;④陰性對照，30min結果與0min比較，兩者差異顯著，P＜0.05;⑤陽性對照，30、45、60min結果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;⑥質控血清，15、30、45、60min結果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;⑦30、45、60min結果分別與15min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05。ELISA抗 －HIV酶標反應板放置時間越長，各標本的檢測值總體越大，見表1。

表1 ELISA抗－HIV檢測結果 (S/CO)及比較 ±S)

表1 ELISA抗－HIV檢測結果 (S/CO)及比較 ±S)

注:▲表示與0min比較，P＜0.05;★表示與15min比較，P＜0.05。

檢測樣本0.054±0.0086弱陽性標本 16 2.17±0.16 2.25±0.18 3.19±0.27▲★ 3.53±0.31▲★ 3.86±0.29▲★陽性標本 16 11.53±0.77 12.31±0.81▲ 15.91±1.69▲ 16.58±1.61▲ 18.33±1.71▲陰性對照 11 0.063±0.0082 0.070±0.0077 0.055±0.0072▲ 0.063±0.0093 0.070±0.0084陽性對照 9 22.93±1.86 24.69±2.12 26.71±2.48▲ 28.05±3.08▲ 28.65±3.72▲質控血清 9 1.98±0.14 2.24±0.13▲ 3.02±0.23▲★ 3.25±0.28▲★ 3.85±0.29 0min 15min 30min 45 min 60min陰性標本 16 0.055±0.0083 0.062±0.0099▲ 0.055±0.0077 0.070±0.0105▲n▲★

2.2 ELISA抗－HCV酶標反應板在室溫23℃、濕度68%條件下，分別放置0、15、30、45、60min后進入BEPIII檢測。檢測結果經統計后比較顯示:①陰性標本60min結果與0min比較，兩者差異顯著，P＜0.05;②弱陽性標本15、30、45、60min結果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P ＜0.05;③30、45、60min結果分別與15min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05。④陽性標本15、30、45、60min結果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;⑤陰性對照，15、30min結果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;⑥陽性對照，30、45、60min結果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;⑦質控血清，15、30、45、60min結果分別與0min比較，均為兩者差異顯著，P＜0.05;⑧30、45、60min結果分別與15min比較，均為兩者差異顯著，P ＜0.05。ELISA抗－HCV酶標反應板放置時間越長，各標本的檢測值總體越大，見表2。

表2 ELISA抗－HCV檢測結果 (S/CO)及比較 (±S)

表2 ELISA抗－HCV檢測結果 (S/CO)及比較 (±S)

注:▲表示與0min比較，P＜0．05;★表示與15min比較，P＜0.05。

0 min 15min 30min 45 min 60min陰性標本 16 0.057±0.0120 0.050±0.0115 0.064±0.0166 0.057±0.0123 0.071±0.0178▲n弱陽性標本 16 1.08±0.06 1.61±0.14▲ 1.89±0.13▲★ 2.13±0.19▲★ 2.23±0.17▲★陽性標本 16 9.36±0.59 12.06±0.95▲ 15.36±1.45▲ 15.95±1.80▲ 16.38±1.70▲陰性對照 11 0.043±0.0090 0.057±0.0103▲ 0.057±0.0131▲ 0.036±0.0086 0.050±0.0110陽性對照 10 20.83±2.29 22.40±2.91 23.51±3.29▲ 24.72±3.11▲ 25.24±3.81▲質控血清 9 5.43±0.33 7.31±0.52▲ 9.59±0.80▲★ 9.90±1.08▲★ 10.41±0.81▲★

3 討論

由表1可知:①對于低值陰性標本和陰性對照，不同預孵時間對抗－HIV檢測結果，統計學表明，方差是齊的。但是，在統計學意義上，有與無并存，無多于有 (5比3)，且無規律性。估計與孔間非特異性結合的差異有關，沒有進一步探討。②對于抗－HIV弱陽性標本，室溫放置30min，其檢測結果是，方差是齊的，但是，結果有顯著性差異 (P＜0.05);往后時間，不單方差不齊，其結果的差異也越見明顯。③對于抗－HIV陽性標本，室溫放置15min，其結果與正常相比，已有顯著差異 (P＜0.05);往后時間，其方差都是不齊的，且統計學上的差異更加顯著。④對于陽性對照，其方差都是齊的，估計是與抗體的高濃度有關。但是，室溫放置30min之后，結果在統計學上也都有顯著差異。⑤對于低值質控血清，其方差是齊的，但是，15min起，其結果就有統計學意義 (P＜0.05)，而且越往后越見顯著。⑥對于弱陽性標本和低值質控血清，經統計分析，③④⑤分別與②相比較，其結果都有統計學意義 (P＜0.05)。同時，隨著預孵時間的增加，④與③、⑤與④相比較，其差異性已呈明顯下降之勢，有的已無統計學意義。這說明此時血清抗體的滴度已相當低，繼續預孵對提高試劑檢測的靈敏度不僅已無意義，而且增加了出現假陽性的機率。

由表2可知，ELISA抗－HCV檢測結果，經統計，各標本的檢測結果與ELISA抗－HIV是類似的。不同的是前者對預孵時間的增加更為敏感。表現在:第一，對于弱陽性抗－HCV標本，室溫放置15min起，方差不齊，且統計學意義都非常顯著。第二，對于2NCU/m l抗－HCV質控血清，30min起方差不齊，15min起均數的差異就有極顯著的統計學意義。

綜上所述，本次對抗－HIV和抗－HCV的弱陽性標本、陽性標本、陽性對照及質控血清的檢測結果，統計學表明，隨著預孵時間的增加，方差由齊向不齊越見明顯，統計學意義上則越見顯著。特別對于弱陽性標本和低值質控血清的影響更為突出。由兩表統計可見:一方面，若按CV值15%是實驗室可接受的RCV范圍算，預孵15min后，與正常相比較，兩者S/CO值相差都在2SD左右，這是屬于失控范疇，也與資料的報道相符［1，2］;另一方面，由于預孵時間的延長，使得標本檢測結果的S/CO值顯著提高，這說明預孵時間的增加能一定程度地提高試劑的檢測靈敏度，這是有利于降低弱陽性標本的漏檢率;再有，隨著預孵時間的增加，出現假陽性的機率在提高，這可能主要是因為標本所含的抗體量已相當低以及非特異性結合所致。為了確保臨床的用血安全，減少輸血后傳染病的發生率，衛生部臨床檢驗中心早在2002年就要求各級血站必須認真貫徹落實“檢驗的全程質控”［3］。這就要求我們對每一項實驗都要充分估計及檢驗其實驗過程中每一個可能對實驗結果的有效性和準確性有影響的因素。由于北京萬泰ELISA抗－HIV和抗－HCV第一步孵育時間都比較短(都是30min)，所以，預孵時間的增加對其結果的影響是比較大的［4］。本次實驗結果顯示，若科學合理地安排實驗時間和進板順序，使得酶標反應板預孵時間在室溫中不超過15min，那么，不單能提高ELISA抗－HIV和抗－HCV的實驗結果準確性，而且能有效地保證∕提高試劑檢測的靈敏度。

［1］朱遠雁，余俊平，劉濤．加樣時差對獻血者HBsAg ELISA結果的影響［J］，中國輸血雜志，2002，15(4):239．

［2］張伯偉．酶免分析儀檢測抗－HCV結果的質控分析［J］，中國輸血雜志，2004，17(5):356．

［3］鄭懷競．必須做好各級血站實驗室免疫學檢驗的室內全程質量控制［J］。中國輸血雜志，2002，15(5):299．

［4］馮健亮，等．抗－HCV ELISA試劑在全自動酶免分析系統的應用［J］．中國輸血雜志，2002，15(5):342．