人工靶向性M1GS核酶胞內抗HCV活性的研究

羅桂飛 李喜芳 黃志文 張文軍

（廣東藥學院病原生物學與免疫學系，廣州 廣東 510006）

人工靶向性M1GS核酶胞內抗HCV活性的研究

羅桂飛 李喜芳 黃志文 張文軍

（廣東藥學院病原生物學與免疫學系，廣州 廣東 510006）

目的構建對HCV基因組具有特異切割作用的新型靶向性核酶-M1GS。方法針對HCV基因組的保守區(5′UTR)設計并合成一段引導序列，通過PCR擴增直接將該引導序列連接于大腸桿菌核糖核酸酶P的催化亞基(M1 RNA)的3′末端，從而構建一種靶向性M1GS核酶。結果胞內切割實驗表明，所構建的核酶(M1GS-HCV/C76)對HCV 5′UTR具有明顯的切割作用，切割的位點在靶序列77～89 n t之間，屬于特異性切割，具有胞內抗病毒活性。結論構建了一種對HCV 5′UTR具有靶向切割活性的M1GS核酶，且具有胞內抗病毒活性，為動物模型內抗病毒效應的評價提供了實驗材料，為新型抗HCV藥物的研究奠定了基礎。

丙型肝炎病毒；5′非編碼區；核糖核酸酶P；靶向切割

目前全世界大概有1.7億人感染丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV），占世界人口的3%，而我國約有4千萬HCV攜帶者，平均感染率高達3.2%。雖然急性感染階段癥狀輕微，然而高達70%以上HCV感染者發展成慢性過程，轉化成慢性率非常高，可能導致慢性活動性肝炎和肝硬化，甚至肝細胞發生癌變，嚴重威脅著人類的健康[1]。目前，臨床上治療方法比較單一，普遍采用干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）或者IFN-γ聯合病毒唑進行保守治療，但干擾素治療有其局限性，存在著例如療效差、易產生耐藥性等副作用，且價格昂貴、復發率高等諸多不足之處[2]。所以，人們尋找更加有效治療HCV的藥物及方法尤為迫切。本研究針對HCV基因組的保守區（5′UTR）設計并合成一段引導序列，設計了一段GS序列，并將其共價連接至M1 RNA的3＇末端，構建一種靶向性的新型人工核酶——M1GS核酶。體外實驗結果表明，所構建的M1GS核酶（M1GS-HCV/C76）在HCV感染的huh7.5.1細胞中，該核酶能夠顯著抑制靶基因的表達及病毒的復制。說明其具有一定的胞內抗病毒活性，為HCV的治療研究提供了一條新的行之有效的途徑[3]。

1 材料與方法

1.1 ①菌種及質粒：大腸桿菌菌株JM109，購自鼎國生物公司。M1GS-HCV/C167核酶及pcDNA-HCV'UTR重組質粒由本實驗室構建并保存。pFL117質粒和pGEM-3Z載體則由暨南大學周天鴻教授惠贈。PcDNA3.1由本實驗室自行構建并保存。②細胞培養試劑：DMEM培養基、四季青胎牛血清、胰蛋白酶、DMSO均購自威佳公司。PBS由本實驗室自行配制并保存。③細胞及病毒：人肝臟細胞系Huh7 .5.1和丙型肝炎病毒JFH-1(武漢大學吳建國教授惠贈）④轉染劑：碧云天Lipofectin2000購自杰順公司。⑤載體構建主要試劑：DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000、KpnI BamHI、T4 DNA連接酶及Premix Taq酶購自TaKaRa。DNA Marker III、微量質粒提取試劑盒及DNA片段純化試劑盒購自杰順生物公司。酵母提取物、胰化蛋白胨購自環凱微生物科技有限公司。四環素、氨芐青霉素購自杰順公司。丙烯酰胺和N，N’-亞甲丙烯酰胺、SDS、APS、TEMED、HCVcore單抗（鼠源）及辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG購自威佳公司。

1.2 M1GS的克隆和鑒定

1.2.1 M1GS-HCV/C76原核表達載體的構建

以KpnI和BamH對M1GS核酶PCR回收產物和pGEM-3Z載體進行雙酶切，恒溫水浴37℃，過夜，加10×Loading Buffer 2μL終止反應，然后用DNA片段純化試劑盒進行純化。然后凝膠純化回收。以T4 DNA Ligase將雙酶切的HCV核心基因PCR回收產物和pGEM-3Z載體進行連接反應，接著制備感受態細胞，并將其與連接體進混合，進行轉化，形成重組子。20h后，質粒在含氨芐青霉素的LB平板中挑取轉化子單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，恒溫搖床37℃，180r/min過夜培養，用微量質粒提取試劑盒提取重組質粒[4]。

1.2.2 核酶M1GS的體外轉錄核酶RNA的制備

以BamHI對PGEM-core質粒進行單酶切即線性化，37℃反應10min，然后用DNA片段純化試劑盒進行純化。再以綠豆芽酶對線性化的PGEM-HCV質粒5′進行平滑，置于恒溫水浴箱37℃，過夜，加10×Loading Buffer 2μL終止反應，然后用DNA片段純化試劑盒進行純化。所獲得的線性質DNA作為體外轉錄的模板。在T7 RNA聚合酶的催化作用下進行體外轉錄[5]。轉錄方案參照TaKaRa公司的使用說明書。轉錄后的產物用DNase I消化30 min、苯酚氯仿抽提1次，乙醇沉淀2次，純化產物保存于80%乙醇中備用。

1.2.3 核酶RNA的制備

先利用限制酶BamHI對M1GS-HCV/C76質粒進行單酶切，再以綠豆芽核酸酶對切割產物進行末端平移，所獲得的線性質DNA作為體外轉錄的模板[6]。在T7 RNA聚合酶的催化作用下進行體外轉錄，轉錄方案參照TaKaRa公司的使用說明書。轉錄后的產物用DNase I消化30min、苯酚氯仿抽提1次，乙醇沉淀2次，純化產物保存于80%乙醇中備用。

1.2.4 M1GS-HCV/C76核酶真核表達載體的構建

限制性核酸內切酶KpnI和BamHI雙酶切M1GS-HCV/C76質粒及pcDNA3.1載體，凝膠回收目的片段，再以T4 DNA Ligase連接經雙酶切的M1GS-HCV/C76核酶基因片段及pcDNA3.1載體[7]。構建了含M1GS-HCV/C76基因的真核表達質粒:pc-M1GS/C76。

1.2.5 胞內抗病毒研究

pc-HCV5'UTR和pc-M1GS/ C76共轉染Huh-7.5.1細胞。實驗分4組，第1、2、3、4組分別為空轉染、pcHCV5'UTR、pcM1GS-HCV/ C167及pcM1GS- HCV/C76與pcHCV5'UTR等摩爾比共轉染Huh-7.5.1細胞[8]。細胞轉染48h后Western Blot 檢測HCV核心蛋白的表達量。在轉染后3d，測定培養細胞的病毒滴度，評價M1GS核酶對HCV病毒生長抑制作用。

2 結 果

2.1 M1GS-HCV/C76核酶及HCV 核心基因真核表達載體的鑒定

將經雙酶切的M1GS DNA片段與經雙酶切的pcDNA3.1載體連接、轉化，并轉化子平板挑取一個菌落進行擴增、提取質粒，最后應KpnI和BamHI對提取的重組質粒進行雙酶切，并行0.8%瓊脂糖電泳進行分析，可見載體均可切出大小兩個片段，大片段如pcDNA3.1 （5427bp）大小相當，小片段與M1GS DNA（512bp）相當[9]。結果見圖1。

圖1 M：DNA kb ladder；1：pcM1GS-HCV/C76重組質粒；2：pcM1GS-HCV/C76重組質粒KpnI 和 BamHI 雙酶切

2.2 M1GS胞內抗病毒研究

細胞轉染48h后，對HCV核心蛋白進行western blot分析，以GAPDH為內參物，表達M1GS -HCV/C76核酶的細胞組，如圖2的（A）所示：HCV核心蛋白的表達水平減少了。確定胞內表達的核酶對HCV的復制是否起了抑制作用，我們做了病毒滴度實驗[7]。如圖2（B）我們可以觀察到，在感染1d后，表達核酶M1GS- HCV/C76的細胞，HCV病毒RNA的拷貝數降低，這些實驗結果證明構建的核酶M1GS-HCV/C76在胞內能有效抑制HCV病毒的復制[8]。

圖2 M1GS在胞內對HCV病毒的抑制（A） Western blot 檢測HCV核心蛋白。（B）表達核酶M1GS的huh 7.5.1細胞的病毒滴度測定

3 結 論

本文成功構建了該核酶的真核表達載體M1GS-HCV/C76，將M1GS核酶導入表達HCV復制子系統的Huh-7細胞，通過半定量RTPCR及Western Blot檢測M1GS核酶在胞內對靶基因及蛋白表達的抑制作用，建立了M1GS核酶的胞內復篩系統，以考察其在胞內體內是否具有抗病毒的效應[9]。

M1GS核酶是一種新型的人工核酶，由GS共價連接到M1 RNA的3′端而成。其既具有M1 RNA的切割功能，又具備GS的引導功能。M1 RNA是E.coli Rnase P的RNA亞單位，能通過識別前體tRNA的二級結構而對其進行切割。GS（Guide Sequence）則是與底物mRNA互補結合的小片段RNA，能引導M1 RNA對底物的互補區域進行特異切割。研究表明，Rnase P對靶RNA的切割可由外部引導序列（External Guide Sequences，EGSs）或連接GS序列的大腸桿菌來源M1 RNA直接介導。

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[4] 鄭永霞,李月琴,李弘劍,等.橋序列在構建人工核酶M1GS中的作用[J].暨南大學學報(醫學版),2005,26(2):151-155.

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[8] 朱勇喆.脂筏對丙型肝炎病毒、日本腦炎病毒和腸道病毒71型細胞入侵的影響及其機制研究[D].上海:第二軍醫大學,2012.

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Determination of the Antiviral Activities of an Artificial M1GS Ribozyme that Targets to the Core Gene of Hepatitis C Virus

LUO Gui-fei, LI Xi-fang, HUANG Zhi-wen, ZHANG Wen-jun

(Department of Pathogen Biology and Immunology, Guangdong Pharmacetical University, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo construct a targeting ribozyme (M1GS) which is specific to HCV genome.MethodsAccording to the sequence of conservative region (5′UTR) of HCV genome, a guide sequence was designed and synthesized. And then by the PCR method, a kind of targeting ribozyme can be constructed by covalently linking the guide sequence to the 3′terminus ofM1 RNA, the catalytic subunit of Rnase P from Escherichia coli.ResultsThe engineered ribozyme (M1GS-HCV/C76 is targeted to the 5′UTR of HCV genome, and can effectively cleave the substrate RNA segment in vitro. The cleavage is specific and the cleavage site is between 77 n t and 88 n t of the target region.ConclusionThe M1GS-HCV/C76 would be a useful experimental material to further study its cleavage activity in vivo, and can be even used for evaluating its anti-viral effect in the animal model It was believed that this study would markedly facilitate the research of a general gene targeting agent for anti-HCV applications and lay the foundation for developing a new nucleic acid drug of anti-HCV therapy.

HCV; 5′UTR; Rnase P; Targeting cleavage

R512.6+3

B

1671-8194（2013）15-0017-02