PDI單抗對創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成大鼠體內(nèi)組織因子活性的影響

王勝權(quán)楊 濤 曹文東 續(xù)慧民 皮興濤 郝 斌*

（山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西大醫(yī)院血管外科，山西 太原 030032）

PDI單抗對創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成大鼠體內(nèi)組織因子活性的影響

王勝權(quán)△楊 濤 曹文東 續(xù)慧民 皮興濤 郝 斌*

（山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西大醫(yī)院血管外科，山西 太原 030032）

目的觀察PDI（protein disulfide isomerase 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶）單抗對創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成大鼠體內(nèi)組織因子（tissue factor TF）活性的影響，初步探討PDI蛋白在組織因子活化中的作用。方法選擇SD大鼠40只，隨機(jī)平均分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組大鼠預(yù)先注射PDI單抗，對照組不加干預(yù)。鉗夾法損傷實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠的右股靜脈，制造大鼠創(chuàng)傷性深靜脈血栓模型，造模后立即抽血，抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測大鼠體內(nèi)TF含量，發(fā)色底物法檢測TF促凝活性，并于第3、10、25h分別抽血，利用ELISA法檢測大鼠體內(nèi)D-二聚體含量，25h后解剖大鼠右股靜脈觀察血栓形成情況。結(jié)果對照組大鼠血清中TF含量及活性均高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.01），3次抽血實(shí)驗(yàn)組大鼠血D-二聚體含量無明顯變化，對照組大鼠成增高趨勢，解剖后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠股靜脈血栓形成范圍、栓子大小及患肢腫脹程度均小于對照組。結(jié)論P(yáng)DI單抗可以抑制大鼠創(chuàng)傷性深靜脈血栓的形成，PDI蛋白在組織因子活化的活化過程起重要作用。

創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成；PDI；組織因子

近年來，血栓性疾病因其高發(fā)病、高危害和治療的高花費(fèi)越來越受到人們的重視，它遍布臨床各個(gè)科室，是臨床醫(yī)師比較棘手的疾病之一，而由于手術(shù)、外傷等創(chuàng)傷性原因造成的創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成的發(fā)病率更是逐年增高。現(xiàn)代凝血理論已經(jīng)證實(shí)TF是生理性凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要啟動(dòng)因子[1]，但是其活化的具體分子學(xué)機(jī)制尚未明確。Ruf等研究發(fā)現(xiàn)：暴露于細(xì)胞便表面的TF的促凝活性其實(shí)是很低的，其表面含有一個(gè)暴露的二硫鍵，只有當(dāng)這一個(gè)二硫鍵轉(zhuǎn)變?yōu)閹€基以后才能形成完全有活性的TF，進(jìn)而發(fā)揮其外源性凝血途徑啟動(dòng)子的作用[2]。PDI蛋白是一種廣泛存在于真核細(xì)胞的氧化還原蛋白家族，具有氧化還原酶、異構(gòu)酶及分子伴侶的作用，能夠催化二硫鍵與巰基之間的互變反應(yīng)。因而本實(shí)驗(yàn)利用PDI單抗作用于大鼠創(chuàng)傷性深靜脈血栓模型，觀察PDI單抗對大鼠創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成的影響，初步探討PDI蛋白在TF活化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD大鼠40只，均為雌性，體質(zhì)量300g左右，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；PDI單抗，美國BD公司產(chǎn)品；大鼠組織因子ELISA試劑盒，山西博士德公司提供；大鼠組織因子發(fā)色底物試劑盒，法國HYPHEN Bio Med公司產(chǎn)品，大鼠D-二聚體ELISA試劑盒購自上海裕平生物科技有限公司。

1.2 方法

①SD大鼠40只，隨機(jī)平均分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠預(yù)先注射PDI單抗（50μg/只）[3]，對照組大鼠預(yù)先不做任何處理。②造模：將大鼠麻妥，固定，消毒后行右腹股溝處內(nèi)側(cè)切口，長約1cm，暴露出股動(dòng)、靜脈及股神經(jīng)，顯露出長約1.5cm的股靜脈，用12.5cm全齒蚊式血管鉗鉗夾1次，力量為血管鉗緊1扣，每次持續(xù)3s，用1號(hào)絲線全層間斷縫合皮膚切口，不放置引流，術(shù)后行髖人字石膏固定[4]。③造模后立即經(jīng)大鼠尾靜脈取血2mL于兩個(gè)枸櫞酸三鈉抗凝管中（各1mL，抗凝劑：全血為1∶9），在室溫下以3500r/min離心6min，取上層血清，-80℃條件下冷藏待用。④采用ELISA法檢測各組大鼠靜脈血中組織因子濃度，發(fā)色底物法檢測各組大鼠靜脈血中組織因子促凝活性，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。⑤相關(guān)文獻(xiàn)及我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)都表明，造模后3h開始有血栓形成，25h血栓形成達(dá)到高峰，因此，于術(shù)后5、10、25h經(jīng)大鼠尾靜脈采血，ELISA法檢測兩組大鼠體內(nèi)D-二聚體的含量。⑥25h后解剖大鼠患肢，切除股靜脈，觀察血栓形成情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件，TF濃度和活性比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，D-二聚體的變化采用重復(fù)測量進(jìn)行比較。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ—± s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠TF含量及濃度變化

對照組大鼠血清中TF含量及活性均高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組大鼠TF濃度及活性變化(χ—±s)

2.2 兩組大鼠體內(nèi)D-二聚體含量變化

對照組大鼠體內(nèi)D-二聚體含量成逐漸增高趨勢，實(shí)驗(yàn)組大鼠體內(nèi)D-二聚體含量較低，無明顯增高趨勢。見圖1。

圖1

2.3 25h后，解剖大鼠患肢，取出大鼠股靜脈，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠股靜脈形成的例數(shù)及栓子大小、長度均小于對照組，根據(jù)栓子長度，將血栓分為無血栓，原位血栓及蔓延血栓3種情況，無肉眼可見血栓為無血栓，2mm以內(nèi)的為局部血栓，＞2mm的為蔓延血栓。具體結(jié)果見表2。

表2 兩組大鼠血栓形成情況(只)

3 討 論

組織因子是一種由263個(gè)氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為47000的單鏈跨膜糖蛋白，由血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞合成，作為一種膜受體，其細(xì)胞外部分是激活凝血系統(tǒng)所必需的。TF是外源性凝血途徑的啟動(dòng)因子，當(dāng)其與FVIIα結(jié)合生成復(fù)合物激活凝血因子X，從而啟動(dòng)凝血反應(yīng)，導(dǎo)致病理性血栓的形成[5]。一旦形成血栓，就會(huì)同時(shí)激活機(jī)體的纖溶系統(tǒng)使血栓溶解，產(chǎn)生分子大小、結(jié)構(gòu)不同的降解產(chǎn)物，其中D-二聚體為纖維蛋白原特異性降解終產(chǎn)物。血漿D-二聚體水平的升高，表明體內(nèi)已有血栓形成，并且已發(fā)生了降解[6]。而正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞并不表達(dá)TF，故健康人血漿中TF含量極低[7]。當(dāng)血管內(nèi)皮功能失衡或血管內(nèi)存在刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF的因素時(shí)，就有可能啟動(dòng)凝血過程。我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)也表明損傷大鼠股靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，造成TF暴露后可導(dǎo)致大鼠創(chuàng)傷性深靜脈血栓的形成，故抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF已成為抗血栓形成的主要手段。

PDI蛋白家族是一類在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中起作用的巰基-二硫鍵氧化還原酶。它們通常含有CXXC（Cys-Xaa-Xaa-Cys，CXXC）活性位點(diǎn)，活性位點(diǎn)的兩個(gè)半胱氨酸殘基可催化底物二硫鍵的形成、異構(gòu)及還原。所有PDI家族成員包含至少一個(gè)約100個(gè)氨基酸殘基的硫氧還蛋白同源結(jié)構(gòu)域。PDI家族的主要職能是催化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生肽鏈的氧化折疊，另外在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)降解途徑（ERAD）、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、鈣穩(wěn)態(tài)、抗原提呈及病毒入侵等方面也起重要作用[8]。由于PDI蛋白能夠催化二硫鍵與巰基之間的互變反應(yīng)，且能催化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大部分新生肽鏈的氧化折疊，因而設(shè)想通過一些實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其是否在TF的活化過程中起作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PDI抗體預(yù)先干預(yù)的大鼠在血管被損傷后形成血栓的概率或程度明顯小于空白對照組大鼠。通過該實(shí)驗(yàn)，我們可以認(rèn)為PDI蛋白參與了TF的活化過程，抑制PDI蛋白就可以抑制TF的促凝活性，減少血栓形成。PDI蛋白可以作為將來新的抗凝藥物的研究靶點(diǎn)，為新的抗栓藥物的研制提供理論幫助。

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PDI Monoclonal Antibody Have Influence on the Activity of Tissue Factor Which Exist in the Rats that Get Traumatic Deep Venous Thrombosis

WANG Sheng-quan,YANG Tao,CAO Wen-dong,XU Hui-min,PI Xing-tao,HAO Bin

(Department of Vascular Surgery, Shanxi Dayi Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030032, China)

[Abstrct] ObjectiveObserve the influence of PDI monoclonal antibody on the activity of tissue factor which exist in the rats that get traumatic deep venous thrombosis , explore the role of PDI protein in tissue factor activation.Mothods40 SD rats were randomly divided into experimental and control groups, the experimental rats pre-injection PDI mAb, control group without intervention. Forceps injury the right femoral vein of rats, both experimental and control groups, manufacturing traumatic deep vein thrombosis model, blood immediately after modeling, antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay detection rats TF content, chromogenic substrate assay TF procoagulant activity, At 3, 10 and 25hour respectively for blood, rats measured by ELISA D-dimer. Anatomical rat right femoral vein observed thrombus formation after 120h.ResultsTF content and activity of the experimental group were higher than in the control group serum(P＜0.01), D-dimer of experimental rats showed no significant change, The control group of rats into the trend of increasing, anatomical found that the range of experimental rats femoral vein thrombosis, embolus size and degree of limb swelling is less than the control group.ConclusionPDI monoclonal antibody can inhibit the formation of deep vein thrombosis in rats with traumatic,PDI protein plays an important role in the tissue factor activation of the activation process.

Traumatic deep vein thrombosis; Protein disulfide isomerase; Tissue factor

R543

B

1671-8194（2013）15-0071-02

△在讀研究生

*通訊作者：E-mail： tao55555@sina.com