EGCG對人肝癌SMMC-7721細胞增殖抑制作用及對缺氧反應的影響

周 薇戴奇剛鄧 鑫榮孿君王英桂

（1 廣東藥學院附屬第二醫院病理科，廣東 廣州 510300；2 廣東藥學院附屬第一醫院放療科，廣東 廣州 510080；3 廣西中醫學院附屬瑞康醫院科教科，廣西 南寧 530011）

EGCG對人肝癌SMMC-7721細胞增殖抑制作用及對缺氧反應的影響

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（1 廣東藥學院附屬第二醫院病理科，廣東 廣州 510300；2 廣東藥學院附屬第一醫院放療科，廣東 廣州 510080；3 廣西中醫學院附屬瑞康醫院科教科，廣西 南寧 530011）

目的探討表沒食子兒荼素沒食子酸酯(EGCG)對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響以及對腫瘤細胞出現缺氧反應的相關作用機制及其作用。方法用不同濃度的EGCG處理SMMC-7721細胞，用倒置顯微鏡進行細胞形態觀察并拍照記錄；將0，20，50，100，200，400μg/mL的EGCG分別作用于體外培養的對數生長期的SMMC-7721細胞，MTT法檢測細胞生長抑制率；缺氧和EGCG雙因素共同處理SMMC-7721細胞，Western-blot法檢測細胞缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)和血管內皮生長因子(即VEGF)蛋白表達方式；并建立相應的裸鼠肝癌移植瘤模型，通過對其行EGCG試驗性治療后，對移植瘤的生長情況進行觀察，Western-blot方法檢測組織中HIF-1α和VEGF的蛋白表達。結果SMMC-7721細胞隨著EGCG處理濃度的增高，細胞的貼壁能力減弱，貼壁細胞數量減少，細胞體積縮小，核的顏色加深；MTT結果顯示EGCG呈時間、劑量依賴性抑制SMMC-7721細胞生長（P＜0.05）；SMMC-7721細胞在不同濃度EGCG作用下，缺氧培養12h，HIF-1α和VEGF的蛋白表達呈劑量依賴性降低；在200μg/mLEGCG作用下，SMMC-7721細胞隨缺氧時間的延長，HIF-1α和VEGF的蛋白表達呈時間依賴性下降；荷瘤裸鼠在行EGCG腹腔內注射試驗性治療后，其結果顯示，高劑量EGCG組裸鼠的腫瘤重量和體積與低劑量組以及對照組存在明顯差異，具有統計學意義(P＜0.01)，低劑量組裸鼠的腫瘤重量和體積與對照組存在明顯差異，具有統計學意義(P＜0.05)；在本研究中，裸鼠移植瘤的標本Western-blot檢測結果顯示，EGCG可呈劑量依賴性抑制HIF-1α和VEGF的蛋白表達。結論EGCG能在體內外抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖；EGCG能抑制腫瘤缺氧反應及血管生長的作用；其機制可能為降低HIF-1α和VEGF的表達，從而抑制肝癌細胞、肝癌組織的生長及血管生成。

表沒食子兒荼素沒食子酸酯；SMMC-7721細胞；裸鼠；移植瘤；缺氧誘導因子-1α；血管內皮生長因子

茶葉中含有大量的茶多酚類、黃酮類以及黃烷醇等酚類化合物，在這些酚類化合物中，黃烷醇（俗稱兒茶素）的含量最大。在綠茶中，兒茶素的種類主要有表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒荼素沒食子酸酯（EGCG）等，在這些兒茶素中，EGCG的含量高達80%左右。隨著醫療事業的不斷發展以及人們對于兒茶素研究的不斷深入，大量的動物實驗、體外實驗以及流行病學的研究成果表明，兒茶素具有抗腫瘤、抗突變、抗病毒、抗炎、清除自由基、抗氧化等藥理效應以及生物學活性，在兒茶素中，發揮上述效應的主要有效成分為EGCG。此外，還有研究結果表明，EGCG可以通過對腫瘤細胞的生長周期進行阻滯，從而達到對其生長進行抑制的作用，同時，它還可以對蛋白酪氨酸激酶的活性進行抑制，以此來達到防止部分酪氨酸蛋白磷酸化，對細胞的生長進行抑制。尿激酶作為腫瘤生長過程中所需的關鍵酶，腫瘤細胞要想進行轉移、侵襲活動就必須借助于尿激酶等蛋白水解酶的相關作用。EGCG可以通過與尿激酶進行結合，來對其與底物之間的結合進行干擾，最終達到抑制尿激酶活性的目的。EGCG還可以通過對體內某些與癌變有關的酶，例如超氧化物岐化酶（SOD）、鳥氨酸脫羧酶（ODC）等的活性進行抑制，阻止癌基因的表達。

為探討表沒食子兒荼素沒食子酸酯（EGCG）對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響以及EGCG對腫瘤細胞缺氧反應的作用及作用機制，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人肝癌細胞株SMMC-7721購自武漢大學生物保藏中心，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養基（含青霉素100μg/mL、鏈霉素100μg/ mL）在37℃、飽和濕度和5%二氧化碳的恒溫培養箱中培養。選取對數生長期細胞進行實驗。

1.2 動物飼養

4周齡BALB/C裸鼠，21只，體質量14～16g，購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物質量合格證明編號：0066310，SPF級屏障系統飼養。

1.3 藥物和試劑

表沒食子兒茶素沒食子酸脂（EGCG，美國Sigma公司，純度95%）將其溶于PBS中，過濾除菌后于4℃保存備用。噻唑藍 （MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購自Sigma公司；酶標儀（Metertech Inc）；缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）、血管內皮生長因子（VEGF）抗體購自Santa Cruz公司。

1.4 形態學觀察

取對數生長期SMMC-7721細胞按每孔2×103個細胞接種于24孔板內，加入不同劑量的EGCG，使各孔終濃度分別為0，20，50，100，200，400μg/mL，培養48h后倒置相差顯微鏡拍照。

1.5 SMMC-7721細胞培養、干預及測細胞生長抑制率

將SMMC-7721細胞常規培養消化、計數、傳代。將對數生長期SMMC-7721細胞制成5×104/mL細胞懸液，接種于96孔培養板，每孔加入100μL，37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養24h。觀察組分別加入終質量濃度為0，20，50，100，200，400μg/mL的EGCG（同時用RPMI-1640培養液稀釋），每個濃度設5個復孔，每孔加100μL。設不加EGCG的細胞為對照組，并設只加培養液不接種細胞的空白調零孔。細胞繼續培養24、48、72h。每孔加 MTT（5mg/mL）20μL，培養4h，吸棄培養液，每孔加DMSO150μL。充分振蕩10min，于酶標儀上檢測570nm處吸光度值（A值），以空白對照孔調零，求平均值。細胞生長抑制率（%）=（1-觀察組A值/對照組A值）×100%。

1.6 EGCG與缺氧雙因素處理SMMC-7721細胞及Western-blot法檢測HIF-1α和VEGF的蛋白表達

取對數生長期的SMMC-7721細胞，將不同培養瓶中培養液的EGCG終濃度調節為20，50，100，200，400μg/mL，缺氧條件下培養12h后終止培養；取對數生長期的SMMC-7721細胞，培養液中EGCG濃度為100μg/mL，分別缺氧處理3h，6h，12h，24h，48h后終止培養。培養瓶中細胞消化后，TBS/KCL Buffer（pH7.4）重新懸浮后4000rpm離心30sec，棄去上清，加入10mmol/L的Hepes（MgCl21.5 mmol/L、KCL10 mmol/L、DTT1mmol/L）100μL懸浮后冰上放置15min，加入10%Triton x-1004μL，充分振蕩后4℃下13000rpm離心lmin，抽提上清為胞漿蛋白；沉渣加入20mmol/L的Hepes（MgCl2 1.5mmol/L、NaCl 0.42mmol/L、DTT 1mmol/L、甘油25%、EDTA 0.2mmol/L）50μL后，冰上放置30min，4℃下13000rpm離心10min，抽提上清為核蛋白。考馬斯亮蘭蛋白定量。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，380v電轉移30min，蛋白轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，加入一抗，37℃孵育2h，PBS漂洗，在封閉液中稀釋堿性磷酸酶標記的二抗，37℃孵育1h，PBS漂洗3次。濾膜放在新鮮配制的NBT/BCIP底物溶液中顯色20min。

1.7 建立動物模型及Western-blot法檢測HIF-1α和VEGF的蛋白表達

實驗裸鼠共21只，用無菌PBS調整SMMC-7721細胞濃度為1.5×l07個/mL，在裸鼠背部皮下接種SMMC-7721細胞懸液0.2mL，用游標卡尺測量移植瘤最長徑（L）和最短徑（W），按公式V=L×W2×0.52計算瘤體積。待腫瘤體積達100mm3左右時，將裸鼠隨機分為3組，每組7只。分別為生理鹽水組即A組，EGCG低劑量組（10mg/kg）即B組，EGCG高劑量組（50mg/kg）即C組。隔日腹腔注射給藥，0.1mL/10g體質量，連續給藥10次，給藥期間隔日測量鼠體質量及移植瘤體積。末次給藥48h后用頸椎脫臼法處死裸鼠，切取移植瘤，記錄瘤重。于-80℃冰箱中稱取移植瘤組織0.2g，以預冷的PBS洗滌3次并用眼科剪將組織剪碎于EP管中，將組織轉入勻漿器，再加入組織裂解液于4℃研磨，裂解30min，離心，吸出上清液，考馬斯亮蘭蛋白定量。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，380v電轉移30min，蛋白轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，加入一抗，37℃孵育2h，PBS漂洗，在封閉液中稀釋堿性磷酸酶標記的羊抗鼠二抗，37℃孵育1h，PBS漂洗3次。濾膜放在新鮮配制的NBT/BCIP底物溶液中顯色20min。

1.8 統計學分析

采用SPSS12.0軟件對本研究的數據進行統計學的分析，計數資料的對比應用χ2檢驗，而計量資料的對比應用t檢驗，P＜0.05說明差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 倒置顯微鏡觀察不同濃度的EGCG處理SMMC-7721細胞的形態變化

20，50，100，200，400μg/mL，在對SMMC-7721細胞采用不同濃度的EGCG進行處理時，隨著其處理濃度的不斷提高，肝癌腫瘤細胞的貼壁能力減弱，貼壁細胞數量減少，細胞體積縮小，細胞核的顏色也在逐漸加深，其折光性也在不斷增強。隨著培養時間的不斷增強，腫瘤細胞的脫落情況也就越明顯，并能見到許多細胞碎片的產生。而對照組小鼠的肝癌細胞貼壁生長良好，基本上沒有脫落的情況出現，相鄰細胞之間生長致密。

2.2 MTT法測不同濃度EGCG處理的SMMC-7721細胞的生長抑制率：見表1。

表1 不同濃度的EGCG對SMMC-7721細胞生長抑制的效果(n=3，χ—±s)

2.3 EGCG與缺氧雙因素處理SMMC-7721細胞及Western-blot法檢測HIF-1α和VEGF的蛋白表達

SMMC-7721細胞在不同濃度EGCG （400、200、100、50、20μg/mL）的處理下，缺氧培養12h后，HIF-1α的蛋白灰度值分別為（9.23±1.05）、（11.56±1.33）、（15.42±1.24）、（17.64± 1.41）、（20.75±1.56），對照組灰度值為（ 23.17±1.82），400、200、100、50μg/mL與對照組相比，差異有顯著性（P＜0.01）；VEGF的蛋白灰度值分別（11.29±1.36）、（13.56±1.74）、（14.86 ±1.66）、（16.47±1.86）、（21.42±1.70），對照組灰度值為（24.09±1.53），400、200、100、50、20μg/mL與對照組相比，差異有顯著性（P＜0.01）。Western Blot分析灰度掃描顯示：隨著EGCG濃度的不斷提高，VEGF以及HIF-1α的蛋白表達受到移植的程度也就表現得更加明顯，且表現出較強的劑量依賴性。這就說明EGCG可以對缺氧反應中的HIF-1-VEGF通路的作用進行有效地抑制。

在100μg/mLEGCG作用下，SMMC-7721細胞經過不同時間的缺氧刺激（3h，6h，12h，24h，48h），HIF-1α的蛋白灰度值分別為（12.29±1.36）、（16.08±1.74）、（23.07±3.01）、（27.66± 2.34）、（34.85±1.96），對照組灰度值為（43.08±3.02），400、200、100、50、20μg/mL與對照組相比，差異有顯著性（P＜0.01）；VEGF的蛋白灰度值分別（10.54±1.02）、（19.96±1.85）、（30.14± 2.07）、（32.79±2.36）、（41.36±2.06），對照組灰度值為（44.17± 3.06），400、200、100、50、20μg/mL與對照組相比，差異有顯著性（P＜0.01）。Western Blot分析灰度掃描顯示：HIF-1α蛋白表達、VEGF的蛋白水平均隨EGCG作用時間延長不斷降低，時間依賴性明顯。

2.4 EGCG對裸鼠移植腫癌的生長抑制作用及對HIF-1α和VEGF表達的影響

在完成肝癌裸鼠模型的建立后，通過對其腹腔給予一定量的EGCG溶液注射，其結果表明，隨著時間的推移，對照組裸鼠體內的腫瘤體積出現了明顯增加的趨勢，而經過EGCG治療的高劑量以及低劑量實驗組的小鼠，其體內的腫瘤生長情況得到了明顯的抑制，且隨著EGCG劑量的不斷增加，腫瘤生長受到抑制的情況也變得更加明顯。實驗完成后，高劑量組小鼠的腫瘤重量以及體積與低劑量組、對照組相比，存在明顯差異，具有統計學意義（P＜0.01），低劑量組的腫瘤體積和重量于對照組之間存在差異（0.01＜P＜0.05）（圖1）。利用頸椎脫臼法來將裸鼠處死，解剖后并未發現其腹腔以及肺部有腫瘤轉移。腫瘤組織的病理學檢查發現，高劑量組中，3例存在壞死灶，而低劑量組中只見到1例，對照組中未發現腫瘤出現壞死的情況。分別抽提各組裸鼠移植瘤標本的胞漿、胞核蛋白后，高劑量（50mg/ kg）組、低劑量（10mg/kg）組 HIF-1α的蛋白灰度值分別為（10.03 ±1.01）、（13.76±1.85），對照組灰度值為（19.54±1.81），高劑量（50mg/kg）組與對照組相比，差異有顯著性（P＜0.01）；高劑量（50mg/kg）組、低劑量（10mg/kg）組VEGF的蛋白灰度值分別（16.33±1.72）、（23.04±1.35），對照組灰度值為（31.88± 2.01），高劑量（50mg/kg）組、低劑量（10mg/kg）組與對照組相比，差異均有顯著性（P＜0.01）。Western Blot分析結果顯示：在體內EGCG同樣具有抑制HIF-1-VEGF的作用，它還可以通過對缺氧環境下腫瘤新生血管的發生以及發展進行抑制，以此來導致腫瘤內部區域出現大面積的壞死區域。

圖1 EGCG對裸鼠種植瘤重量增加的抑制作用

3 討 論

隨著醫療事業的不斷發展以及人們對于兒茶素研究的不斷深入，大量的動物實驗、體外實驗以及流行病學的研究成果表明，兒茶素具有抗腫瘤、抗突變、抗病毒、抗炎、清除自由基、抗氧化等藥理效應以及生物學活性，在兒茶素中，發揮上述效應的主要有效成分為EGCG。

通過形態學觀察和MTT實驗，其結果表明EGCG能夠對肝癌SMMC-7721細胞的生長表現出時間以及劑量依賴性抑制。大量的動物實驗結果表明，通過對裸鼠的腹腔給予一定量的EGCG溶液注射，可以對種植瘤的生長進行有效地抑制。在本研究中，對照組、低劑量組（10mg/kg）以及高劑量組（50mg/kg）裸鼠的腫瘤重量分別為（2.43±0.3）、（1.56±0.27）、（1.12±0.08）mg，其體積分別為（3016±627.1）、（1997.52±352）、（1416.17±98.44）mm3，高劑量組的抑制效果明顯優于其它兩組，他們之間的差異具有統計學意義，（P＜0.01），且呈現出一定的劑量依賴性。利用EGCG來對SMMC-7721細胞的增殖進行抑制時，其抑制機制非常復雜，出現池中情況的主要原因可能與調節致癌酶活性、誘導凋亡以及阻滯細胞周期等因素有著十分密切的關系。

目前的研究結果表明EGCG抑制腫瘤細胞生長與以下幾點機制相關：①EGCG可以抑制腫瘤細胞的生長周期，使腫瘤細胞停留在某一期。文獻報道，EGCG可PC-9細胞和上皮性癌細胞A43l的生長分別停滯在G2/M期和G0/G1期，且阻滯細胞的數量和EGCG的用量濃度成正相劑量關系；當腫瘤細胞生長阻滯在G1期達到某一程度和時間，仍不能解除阻滯，導致細胞無法進入S期和M/G2期時，細胞無法將正常分化而死亡[4]。②EGCG同時可以引起腫瘤細胞中bcl-2蛋白表達水平下調，并呈時間依賴性關系。Bcl-2是一種最常見的凋亡抑制基因，其過度表達可抑制細胞的凋亡而延長其生存期；EGCG可抑制bcl-2蛋白表達，最終通過助推腫瘤細胞的快速凋亡來實現治療的目標[5]。③在腫瘤生長過程中，尿激酶作為其中的關鍵酶，腫瘤的轉移、侵襲必須借助于尿激酶等蛋白水解酶的協助方可完成，通過對尿激酶的活性進行抑制，可以降低小鼠體內的荷瘤大小，甚至是將其完全清除。EGCG可以通過與尿激酶進行結合，來對其與底物之間的結合進行干擾，最終達到抑制尿激酶活性的目的。EGCG還可以通過對體內某些與癌變有關的酶，例如超氧化物岐化酶（SOD）、鳥氨酸脫羧酶（ODC）等的活性進行抑制，阻止癌基因的表達。

通過對EGCG作用下肝癌細胞的VEGF以及HIF-1α進行研究發現，在體內試驗以及細胞水平的檢測過程中，EGCG均可對VEGF以及HIF-1α的表達進行有效地抑制。并且劑量和時間依賴關系明確。

腫瘤在生長過程中，血管的失控以及持續增長是一種十分普遍的現象，VEGF是其主要的生長誘導因子。而HIF-1α則是腫瘤在缺氧條件下所形成的核轉錄因子，它可以對VEGF等多種靶基因的表達進行調節，它在腫瘤血管的生長過程中有著核心調控的作用。新腫瘤血管在形成的過程中對VEGF的表達具有一定的依賴性，在缺氧環境下，腫瘤細胞表達的重要途徑就是VEGF以及HIF-1α因子的結合誘導。Duffy等[8]在其報道中指出，缺氧環境下，VEGF信號在調節、傳輸的過程中，HIF-1具有中樞紐帶作用，它不僅可以使VEGF mRNA變得更加穩定，而且還可以在一定程度上強化VEGF在轉錄過程中的活性。

綜上所述，EGCG具有抑制肝細胞肝癌中腫瘤的缺氧反應、增殖以及血管的生長等作用，其機制可能與降低HIF-1α和VEGF的蛋白表達相關。EGCG作為肝癌的化學治療和預防藥物前景樂觀。

[1] Brown MD.Green tea (Camellia sinensis) extract and its possible role in the prevention of cancer[J].Altern MedRev,1999,4(5):360-370.

[2] Fujiki H,Suganuma M,Mai K,et al.Green tea:cancer preventive beverage and/or drug[J]. Cancer Lett,2002,188(1-2):9-13.

[3] Saha A,Kuzuhara T,Echigo N,et al New role of (-)-epicatechin in enhancing the induction of growth inhibition and apoptosis in human lung cancer cells by curcumin.[J].Cancer Prev Res (Phila),2010,3(8):953-962.

[4] Yang H,Landis-Piwowar K,Chan TH,et al Green tea polyphenols as proteasome inhibitors: implication in chemoprevention[J].Curr Cancer Drug Targets,2011,11(3):296-306.

[5] Singh M,Singh R,Bhui K,et al.Tea polyphenols induce apoptosis through mitochondrial pathway and by inhibiting nuclear factorkappaB and Akt activation in human cervical cancer cells[J]. Oncol Res,2011,19(6):245-257.

[6] Ho YC,Yang SF,Peng CY,et al Epigallocatechin-3-gallate inhibits the invasion of human oral cancer cells and decreases the productions of matrix metalloproteinases and urokinaseplasminogen activator[J].J Oral Pathol Med,2007,36(10):588-593.

[7] Roskoski R Jr.Vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling in tumor progression[J]. Crit Rev Oncol Hematol,2007, 62(3):179-213.

[8] Duffy JP,Eibl G,Reber HA,et al Influence of hypoxia and neoangiogenesis on the growth of pancreatic cancer[J].Mol Cancer,2003,2(2):12.

R735.7

B

1671-8194（2013）15-0092-04

廣西壯族自治區科學技術廳青年基金資助課題（桂科青0832056）