5種植物提取物抑菌抗侵襲效應比較

姜秋陽,李大軍

(吉林農(nóng)業(yè)大學,吉林長春130118)

我國有植物種類約350 000個,作為生物活性物質(zhì)的天然寶庫,許多植物提取物都可被用來防治細菌、真菌病害[1-2]。在現(xiàn)代食品工業(yè)生產(chǎn)中,生產(chǎn)者常使用人工合成防腐劑來抑制微生物生長[3],如苯甲酸鈉、雙乙酸鈉和丙酸鈣等。不當使用苯甲酸鈉、亞硝酸鹽、過氧化氫等防腐劑,被消費者長期食用,會對人體健康造成一定的威脅[4]。植物種類資源豐富,尋找和利用毒副作用小的、有防腐作用的天然植物提取物,替代人工合成防腐劑,這無論是在食品領域,還是在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等其他領域都具有重要的研究價值和發(fā)展?jié)摿5]。為評價植物的抑菌效果,本研究采用擴散法、比色法、稀釋法3種方法檢測測試和比較五倍子、五味子、石榴皮、丁香、蘆薈提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用[6-8],并且通過雞蛋卵殼膜侵襲實驗測試5種植物提取物的抗侵襲作用,篩選優(yōu)良的抗菌、抗侵襲天然植物提取物,為深入研究天然抗菌物的作用機理和商業(yè)應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 五倍子、五味子、丁香、石榴皮均購自中藥店;蘆薈為實驗室栽培;雞蛋購自超市;無水乙醇、氯化鈉均為分析純,北京化工廠產(chǎn)品;牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉,購自天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心產(chǎn)品;定性濾紙,杭州新華紙業(yè)產(chǎn)品。

1.2 主要儀器 UV-1800型紫外分光光度計,島津貿(mào)易(上海)有限公司產(chǎn)品;FW100型高速萬能粉碎機,天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品;RE52-98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;H-2050R型離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品;LGJ-12型冷凍干燥機,北京松源華星科技發(fā)展有限責任公司產(chǎn)品;ZHA-S恒溫搖床,常州國華電器有限公司產(chǎn)品;SHH-W21型電熱恒溫水浴鍋,上海精宏實驗設備有限公司產(chǎn)品;DHP-781型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品;Eppendorf微量移液器,德國產(chǎn)品。

1.3 供試菌種 金黃色葡萄球菌(S.aureus)為吉林農(nóng)林大學食品安全實驗室保藏菌種。

1.4 方法

1.4.1 5種植物提取物的制備 將五倍子、五味子、丁香、石榴皮、蘆薈經(jīng)粉碎機粉碎,粉碎后的樣品,分別用60%、80%、95%乙醇浸提 48 h,經(jīng)過抽濾、濾液離心(4 000 rpm)、取上清凍干,用無菌水配制成100 mg/mL的溶液。

1.4.2 濾紙片擴散法測試抑菌作用 將斜面活化后的菌種用無菌生理鹽水稀釋,配制成約106 CFU/mL的菌液。普通牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配制好后經(jīng)121℃濕熱滅菌15 min后,冷卻至50℃后倒平板,待培養(yǎng)基凝固后,涂布50 μ L菌懸液于平板上。取直徑6 mm的濾紙片滅菌后置于5種植物提取液中,浸泡20 min后,用無菌鑷子使其平貼于涂布后的瓊脂培養(yǎng)基上,浸泡無菌生理鹽水作為空白對照,丙酸鈣溶液和葡萄糖溶液為參比,每個處理設4個重復。生化培養(yǎng)箱中,37℃條件下培養(yǎng)16 h,用游標卡尺測定抑菌圈直徑。

1.4.3 比濁法測試抑菌作用 取牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(無瓊脂)5分,每分6 mL,滅菌后分別加入0.6 mL 5種提取物液和60 μ L菌懸液,同時,以無菌生理鹽水菌懸液作為對照管,37℃培養(yǎng)16 h,每個處理設4個重復。另取裝有液體培養(yǎng)基的試管,分別加入5種提取液,不接菌種作為空白對照;不加提取液接菌種作為參比。波長600 nm測定樣品管和對照管的OD值,計算抑菌率。

1.4.4 瓊脂稀釋法測試抑菌作用 對提取液進行連續(xù)稀釋,使其濃度為 50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 mg/mL,再將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基滅菌后冷卻至約50℃,與稀釋液按體積比10∶1混勻,待其凝固,吸取 40 μ L菌懸液涂布于培養(yǎng)基表面,37℃培養(yǎng)16 h。以無菌水作為對照,丙酸鈣、葡萄糖溶液作為參比。每個處理設4個重復。觀察以未產(chǎn)生可見菌落的培養(yǎng)皿為植物提取物的最低抑菌濃度(MIC)。

1.4.5 植物提取物抗膜侵襲作用測試 取生產(chǎn)日期和大小相近的雞蛋,氣室端去除直徑為1 cm的蛋殼(保留卵殼膜),另一端去除直徑為2 cm的蛋殼,倒出蛋液,蛋內(nèi)用無菌生理鹽水沖洗10次,氣室端浸入20 mL無菌生理鹽水中,分別向蛋內(nèi)加入0.2 mL 5種提取液和0.2 mL的菌液,同時以無菌水和菌液作為對照和參比,25℃下靜止30 min,每個樣品設4個重復。平板菌落計數(shù)法測定浸入液中菌落數(shù),計算抗侵襲抑菌率。

1.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 試驗處理數(shù)據(jù)差異統(tǒng)計采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和最小顯著差法多重比較,采用英文字母abcd或ABCD進行標注,顯著水平取 P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物與其浸提乙醇濃度對抑菌圈直徑的影響見圖1。

由圖1可知,濾紙片的直徑為6 mm,當樣品抑菌圈直徑為6 mm時,表示無抑菌作用。5種植物提取物均對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生了一定的抑菌作用,當浸提乙醇質(zhì)量分數(shù)為一定時,五倍子、丁香提取物分別與其他提取物的抑菌效果有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),且五味子的抑菌效果最佳,當浸提乙醇質(zhì)量分數(shù)為95%時,分別與其他兩處理組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),其次是丁香提取物的抑菌效果,當浸提乙醇質(zhì)量分數(shù)為80%、95%時,有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 不同濃度乙醇植物提取物的抑菌圈直徑比較

2.2 植物提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌率 見圖2。

圖2 比濁法測試不同濃度乙醇植物提取物的的抑菌率比較

由圖2可知,5種植物提取液中,80%乙醇提取的五味子溶劑抑菌率最高,可達25.85%,95%乙醇提取的五倍子溶劑抑菌率最低,為12.4%,當浸提乙醇質(zhì)量分數(shù)為一定時,五味子提取液與其他各提取液抑菌效果有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),其中,當浸提乙醇質(zhì)量分數(shù)為80%、95%時,五味子提取液抑菌效果有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),當浸提乙醇質(zhì)量分數(shù)為80%時,石榴皮提取液分別與其他2個處理組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 植物提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC) 見表1。

2.4 植物提取物對金黃色葡萄球菌的抗侵襲作用見圖3。

表1 瓊脂稀釋法測試植物提取物與其乙醇浸提濃度的抑菌作用 mg/mL

圖3 植物提取物對金黃葡萄球菌浸染卵殼膜滲透的抗侵襲作用

由圖3可知,5種植物對金黃色葡萄球菌都有一定的抑制作用,且乙醇溶劑濃度的不同對植物提取物的抗侵襲抑菌率影響較小,當以雞蛋卵殼膜為天然濾膜,五味子、石榴皮、丁香提取物表現(xiàn)出良好的抗侵襲抑制能力,當浸提乙醇質(zhì)量分數(shù)為80%時,五味子提取液的抑菌效果最佳,與石榴皮、丁香提取液抑菌效果有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),與五倍子、蘆薈提取液抑菌效果有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),但在浸提乙醇質(zhì)量分數(shù)不同時,只有五倍子提取液有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

本研究僅就不同濃度乙醇溶液的植物浸出物的抗菌和抗侵襲作用進行分析。乙醇液中水分含量高,則溶液極性增強,對極性物質(zhì)的浸提能力增加,反之亦然。80%乙醇溶液適于抽提抑菌能力強的組分,濃度增大或減小,降低了對目標物的浸提能力并改變浸提組分構(gòu)成。各種植物提取物抑菌能力有所差異,同樣取決于植物本身活性成分含量和屬性,同等試驗條件下,五味子綜合抑制能力最好。

常見的半透膜材料有:腸衣、玻璃紙、雞蛋卵殼膜、膀胱膜等,絕大多數(shù)生物吸取養(yǎng)分就是通過半透膜進行的[9]。雞蛋卵殼膜作為天然半透膜可分為2層,外層膜較厚,內(nèi)層膜較薄,2層膜中間形成氣室,本實驗采用的是較薄內(nèi)層膜,因此,分離時需要格外小心。加入植物提取物和菌液后,植物提取物分子吸附于微生物表面活性位點,破壞了菌體細胞壁、細胞膜的結(jié)構(gòu)完整性,抑制核酸和蛋白質(zhì)的形成,干擾細胞的正常能量代謝過程,使得菌體透過卵殼膜的速度受到抑制作用。

比較以上測定抑菌效應方法,濾紙片擴散法能夠較為直觀的判定5種植物提取物的抑菌作用,需要用尺子測量抑菌圈直徑,誤差是難以避免的;瓊脂稀釋法的敏感性比較高,能夠準確判斷植物提取物的最低抑菌質(zhì)量濃度[10];利用紫外分光光度計測定植物提取物的抑菌率(比濁法)和平板菌落計數(shù)法測定植物提取物的抗侵襲抑制率與其他兩種方法相比準確性高,但溶劑濃度對抗侵襲抑制率的影響較小,因此,比濁法更適合精確測定提取物的抑菌效應。

[1]Bowers JH,Loche JC.Effect of formulated plant extracts andoils on population density of phytophthora incotianae in soil and control of phytophthora blight in the greenhouse[J].Plant Disease,2004,88(1):11-16.

[2]KM J,Choig J,Lee S W,et al.Screening extracts of Achyranthes japonica and Rumex crispus for activity against various plant pathogenic fungi and control of powdery mildew[J].PestManagement Science,2004,60:803-808.

[3]李玲.國外食品防腐劑生產(chǎn)與使用現(xiàn)狀[J].精細與專用化學品,1996(14):27-29.

[4]李大軍,權(quán)伍榮.過氧化氫對小鼠骨髓微核率和孕鼠胚胎著床及生長的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報,2007,29(6):700-704.

[5]Swain T.Secendary compound as protective agents[J].Am Rev Plant Physical,1977,28:479-501.

[6]劉春云,武廷章,周大喜,等.鳳丹丹皮酚抗菌作用的研究[J].生物學雜志,2000,17(3):23-24.

[7]Malkoskim K.A novel antibacterialmilk[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2001(8):2309-2315.

[8]馬緒榮,蘇德模.藥品微生物檢驗手冊[M].北京:科學出版社,2000.

[9]趙法利,劉靜波,劉瑜,等.雞蛋中功能成分的研究[J].食品科學,2006,27(12):798-802.

[10]馬建鳳,劉華鋼,朱丹.中藥體外抑菌研究的方法學進展[J].藥物評價研究,2010,33(1):42-45.