咳爾康口服液對哮喘大鼠TNF-α和SOD mRNA表達的影響※

李厚忠張羽飛齊 敏李孟全

咳爾康口服液對哮喘大鼠TNF-α和SOD mRNA表達的影響※

李厚忠1張羽飛1齊 敏2李孟全1

目的觀察咳爾康口服液對哮喘模型大鼠TNF-α和SOD活力及其 mRNA表達的影響，闡明咳爾康口服液治療哮喘的可能機制。方法SD大鼠隨機分為四組：正常對照組、模型組、陽性對照組和咳爾康口服液實驗組。采用卵蛋白和氫氧化鋁制備哮喘模型大鼠，觀察咳爾康口服液對大鼠TNF-α和SOD mRNA表達的影響。結果與正常對照比較，模型組大鼠TNF-α mRNA表達明顯升高；與模型組相比，咳爾康口服液可以降低TNF-α mRNA表達，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與正常對照比較，模型組大鼠SOD mRNA表達明顯降低；與模型組相比，咳爾康口服液可以升高SOD mRNA表達，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論TNF-α和SOD可能參與哮喘的發生，而咳爾康口服液治可以抑制TNF-α mRNA表達水平，同時也可以升高SOD mRNA表達水平，改善哮喘的癥狀。

咳爾康口服液；哮喘；TNF-α；超氧化物歧化酶

咳爾康口服液是在經典名方“六君子湯”基礎之上，經過反復多年實踐潛心研究衍化而成。主要成分包括茯苓、陳皮、甘草、紫苑、白術等，具有理氣健脾燥濕，化痰止咳之功效。本課題組前期研究結果表明該制劑作用機制可能與降低NO和MDA濃度有關[1]，長期毒性實驗也未見明顯毒性反應[2]。

細胞因子TNF-α是一種多效應的生物活性分子，也是哮喘發病過程中的一個重要的啟動因子，它作為氣道強而有力的刺激劑，可以誘導一系列細胞因子的產生。SOD是機體重要的抗氧化酶類，作為氧化——抗氧化研究的經典指標，得到廣泛應用。本實驗以TNF-α和SOD為研究對象，研究在哮喘模型大鼠血清中TNF-α濃度和SOD活力的變化以及其基因表達情況，評價TNF-α和SOD在哮喘發病過程中的作用，為進一步研究咳爾康口服液治療哮喘的機制提供參考資料，也為該制劑在臨床應用中提供理論基礎和實驗依據。

1 實驗材料

1.1 試藥咳爾康口服液制備：處方藥材用清水速洗，水煎兩次，合并煎液，除塵，濃縮至規定量，分裝滅菌既得，黑龍江仁和堂藥業有限公司代加工。

1.1.1 動物健康清潔級 SD系大鼠40只，雌雄各半，體重190～210g，購于哈爾濱醫科大學動物實驗中心，實驗動物合格證號為：P00102008，實驗動物使用許可證號：SYXK（黑）2008-033。

1.1.2 儀器和試劑恒溫水浴箱（天津泰斯鵬儀器有限公司）；微量加樣器（德國eppendorf）；自動平衡離心機（北京京立離心機有限公司）；電子天平（日本島津）；超聲霧化器（江蘇魚躍醫療設備股份有限公司）；PCR儀（美國Bio-Rad公司）；NanoDrop2000（美國Thermo Fisher公司）；BioAnalyzer 2100（美國Agilent公司）。RNA 提取液（TRIzol，美國Invitrogen公司）；RT-PCR試劑盒（購自寶生物工程有限公司）；瓊脂糖（Agarose）；EB（美國sigma公司）；卵蛋白（OVA，美國Sigma 公司）；潑尼松（天津力生制藥股份有限公司）；TNF-α測試盒（美國ADL公司）；SOD測試盒（南京建成生物工程研究所）。其余試劑均為國產分析純（北京化工廠）。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法健康清潔級SD大鼠腹腔內注射10%卵蛋白+10%氫氧化鋁混合液1ml作為首次致敏，第15天將大鼠依次置于超聲霧化器中，用1%卵蛋白生理鹽水噴霧激發大鼠哮喘發作，隔日一次，一次20min，共激發28d。以大鼠出現口唇發紺、腹肌痙攣、呼吸加快、點頭呼吸或站立不穩等表現表示成功激發。將成功制備的哮喘模型大鼠（40只）隨機分為四組（每組10只），分別為咳爾康口服液給藥組（Experimental group）、模型組（Model group）、陽性對照組（Positive group）、另設正常對照組（Control group，10只以生理鹽水代替卵蛋白進行腹腔注射及霧化吸入給藥）。分組后每天灌胃給藥，正常對照組和模型組給予等量生理鹽水，陽性對照組給予潑尼松10 ml/kg體重，給藥組給予咳爾康口服液1.66ml/200g體重，每天1次，連續28d。最后1次給藥后2h頸靜脈采血2ml，于3000r/min離心機離心10min后取上清液待檢測TNF-α濃度和SOD活力。右肺組織取出后，立即置于-80℃冰箱中保存，用于TNF-α與SOD基因mRNA的檢測。

1.2.2 肺組織總RNA提取及質量鑒定按照TRIzol試劑說明書的步驟，逐步提取出各組肺組織的總RNA。應用NanoDrop2000測定總RNA 的吸光度A260 值和A280值，用A260 值計算其濃度，并計算A260/A280檢測其純度；使用2100生物分析儀器進一步檢測總RNA質量。

1.2.3 RT-PCR肺組織TNF-α和SOD mRNA表達水平檢測使用RNA 1μg 以及oligo（dT）引物，使用RT-PCR試劑盒進行反轉錄反應，合成單鏈的cDNA。cDNA 產物保存在-20℃。RT-PCR 反應體系：體積為20μL，SYBR Green Taq Ready Mix 10 μL，dNTP正向和反向引物1μL，水7μL 和cDNA 1μL。反應程序為：50℃升溫2 min；95℃預變性10 min；95℃變性15 s；60℃退火1 min；擴增40 個循環。每個樣本以內參基因Rps16調整。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳后通過凝膠成像分析系統觀察并保存圖像。引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

1.3 數據統計分析所有實驗數據均以均數±標準差（±s）表示，統計學處理均采用t檢驗法進行顯著性檢驗，P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 咳爾康口服液對哮喘模型大鼠血清TNF-α濃度和SOD活力的影響

表2 咳爾康口服液對哮喘模型大鼠血清TNF-α濃度和SOD活力的影響(n=10,±s)

表2 咳爾康口服液對哮喘模型大鼠血清TNF-α濃度和SOD活力的影響(n=10,±s)

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較※P＜0.05

組別 TNF-α(umol/L) SOD(U/mgprot)正常對照組 6.15±1.04 109.64±15.91模型組 9.94±1.72※99.88±16.62※陽性對照組 4.93±1.12**169.17±14.09**給藥組 6.57±1.50*115.44±9.43*

咳爾康口服液對TNF-α濃度的影響見表2，模型組的TNF-α濃度與正常對照組比較明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；給藥組的TNF-α濃度與模型組比較明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。模型組的SOD活力濃度與正常對照組比較明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；給藥組的SOD活力與模型組比較明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 總RNA 的質量檢測用Trizol溶液分別提取肺組織總RNA，操作按試劑盒進行。NanoDrop2000測定總RNA濃度（260nm），A260/280值在1.8～2.1之間，A260/230大于1.8，說明很酸純度較高（比值未列出）。使用2100生物分析測定總RNA完整性，完整性RIN均為10，表明RNA無降解，質量可靠（圖1）。上述實驗結果表明，各樣本RNA 均有較好的質量，完全可以滿足后續的RT-PCR 的實驗要求。

圖1 部分樣品RNA完整性檢測

2.3 咳爾康口服液對哮喘模型大鼠支氣管平滑肌TNF-α和SOD mRNA的表達情況圖2結果顯示，哮喘模型大鼠SOD mRNA的表達較對照組降低，TNF-α mRNA的表達較正常對照組增高。哮喘給藥處理后，大鼠SOD mRNA的表達有所升高，TNF-α mRNA的表達有所降低，與陽性對照組表達一致。

圖2 PCR結果

3 討論

支氣管哮喘是臨床上常見的慢性多發疾病，具有反復發作、遷延難愈的特點。在哮喘的發病過程中，有多種炎癥基因表達增加或多種炎癥基因異常表達的炎癥反應。TNF-α是由單核巨噬細胞所產生的一種多肽細胞炎性介質，與機體的炎癥、免疫反應有著十分密切的關系，在哮喘的發病過程中起重要作用。正常人血清TNF-α的濃度很低，適量的TNF-α對機體的保護反應是必需的，但當TNF-α受到過敏原等刺激后可大量釋放，加重氣道炎癥以及引起哮喘發作[3]。哮喘發作期患者TNF-α濃度明顯高于緩解期及正常對照組，而且哮喘病情越嚴重，持續時間越長，其血清TNF-α濃度越高[4]，這與本實驗的研究結果恰恰相符。本實驗中，采用ELISA法測定了哮喘模型大鼠血清TNF-α濃度，結果發現哮喘模型大鼠血清TNF-α濃度均較正常對照組明顯增高，由此可以認為TNF-α參與了哮喘的發生。而后進一步應用RT-PCR法測定了哮喘模型大鼠肺組織TNF-α mRNA的表達。結果表明，哮喘模型大鼠TNF-α mRNA的表達較正常對照組增高，說明哮喘模型大鼠TNF-α濃度升高可能系由肺組織TNF-α mRNA表達增加，TNF-α生成增多，釋放入血所致。由此可見，TNF-α與哮喘有著密切關系，參與哮喘的病理生理過程。給藥組給予咳爾康口服液干預治療后，哮喘模型大鼠血清TNF-α濃度明顯降低，同時肺組織TNF-α mRNA表達也相應降低，由此可以認為，咳爾康口服液可能是通過降低哮喘模型大鼠肺組織TNF-α mRNA表達進而降低血清中TNF-α濃度來發揮緩解哮喘的發作。

超氧化物歧化酶（SOD）是體內重要的抗氧化酶，其活性可衡量體內抗氧化系統防御自由基損傷的能力[5]。研究表明哮喘發作過程中可產生大量氧自由基。氧自由基能顯著增強細胞膜的脂質過氧化作用，消耗大量SOD損害氣道壁上皮細胞，促進氣道高反應性和氣道重塑形成而引起哮喘[6]。本實驗研究表明，哮喘模型大鼠模型組SOD活力明顯低于正常對照組（P＜0.05），而肺組織SOD mRNA的表達亦低于正常對照組，這表明SOD可能參與哮喘的發生。咳爾康口服液可增加SOD mRNA的表達進而升高血清SOD活力，增強機體的抗氧化能力。

[1]李厚忠,林峰,金秀東.咳爾康口服液對哮喘大鼠幾種生化指標的影響[J].毒理學雜志,2011,25(1)：46-48.

[2]李厚忠,孫展鵬,王元奕.咳爾康口服液長期毒性實驗[J].毒理學雜志,2009,23(6)：508-509.

[3]Shakoory B,Fitzgerald SM,Lee SA,et al.The role of humanmast cell-derived cytokines in eosinophil biology[J].J Interferon Cytokine Res,2004,24(5)：271.

[4]Silvestri M,Bontempelli M,Giacomelli M,et al.High serum levels of tumour necrosis factor-alpha and interleukin-8 in severe asthma：markers of systemic inflammation[J].Clin Exp Allergy, 2006,36(11)：1373.

[5]張伊偉,葉發民,魏文啟.支氣管哮喘患者外周血IL-4、TNF-α測定及臨床意義[J].臨床醫學,2005,25(4)：82.

[6]邱晨,史菲.肺表面活性物質對哮喘大鼠血清一氧化氮、丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性的影響[J].中國呼吸與危重監護雜志,2004,3(5)：312-313.

Keerkang Oral Liquid on the Expression of TNFαand SOD mRNA in Asthmatic Rats

Li Houzhong Zhang Yufei Qi Min Li Mengquan

ObjectiveTo evaluate the effect of Keerkang Oral Liquid on activities of TNF-α and SOD and the expression of TNF-α and SOD mRNA in asthmatic rats.MethodsThe asthmatic models were established by injecting ovalbumin (OVA) into abdomen and atomization, then treated with Keerkang Oral Liquid.The serum was collected for detecting the levels of TNF-α and SOD .Lung tissues were ground into homogenate and the expression of TNF-α and SOD mRNA was assayed using RT-PCR.ResultsCompared to control group, the levels of TNF-α mRNA were significantly higher, but the expression of SOD mRNA decreased in asthmatic group.After Kerkang oral liquid treatment, the levels of TNF-α mRNA were significantly lower, and the expression of SOD mRNA increased in therapeutic group compared to the asthmatic group.ConclusionKeerkang Oral Liquid could decrease the expression of TNF-α mRNA and increase the expression of SOD mRNA.So it might have certain preventive and therap- SODeutic effect on Asthma.

Keerkang Oral Liquid; Asthma; TNF-α; Superoxide dismutase

R99

A

1673-5846(2013)08-0193-03

1牡丹江醫學院藥學院，黑龍江牡丹江 157011

2牡丹江醫院附屬二院，黑龍江牡丹江 157011

黑龍江省衛生廳科研課題（編號：2010-233）；黑龍江省中醫藥管理局（編號：ZHY10-W73）

李厚忠（1979-），男，黑龍江省哈爾濱市呼蘭區人，碩士，主要從事藥理學和毒理學研究。

李孟全（1962-），女，博士，教授，主要從事心血管藥理學研究工作。Email：lmq6204@126.com。