氨氯地平對糖基化低密度脂蛋白誘導的血管內皮功能障礙的修復作用

洪 虹，馬小羽，蔡冬梅，蔣麗娟，曹翠平

糖尿病是一種在全球范圍內高發的慢性疾病，其動脈硬化的并發癥是導致死亡的主要原因之一［1］。內皮功能障礙以內皮細胞促氧化及促炎癥反應的增強為特征，是動脈粥樣硬化、糖尿病及高血壓所共有的一種機體內環境紊亂。動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥反應失調，以巨噬細胞和T淋巴細胞在動脈內膜上的聚集為特征。巨噬細胞在動脈粥樣硬化斑塊上的聚集主要是由血液中粘附于內皮細胞的單核細胞衍生而來的。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)是參與循環中單核細胞聚集于炎癥靶位的一個主要的趨化因子。在糖尿病患者中可以檢測到循環中MCP-1 水平的升高［2-4］。血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)是一種參與單核細胞在內皮細胞上滾動的蛋白質，其在動脈粥樣硬化及糖尿病患者中亦有升高［5］。糖尿病中動脈粥樣硬化的加速發展可以用血漿葡萄糖水平升高引起糖化蛋白與脂類相互作用而導致血管細胞功能的改變來解釋［6-7］。血漿蛋白中的低密度脂蛋白(LDL)在糖尿病環境中被糖基化，這種糖基化的低密度脂蛋白在糖尿病患者中的水平要高于正常對照人群［8］。氨氯地平(Amlodipine，Am)是一種二氫吡啶類L-型鈣離子通道阻滯劑，其成功地用于阻止高血脂動物模型的動脈粥樣硬化進程［9］，限制糖尿病高血壓患者的心血管事件的發生。本研究通過對人內皮細胞進行糖基化低密度脂蛋白(AGE-LDL)的處理來模擬體外糖尿病合并脂代謝異常環境，通過AGE-LDL 誘導人內皮細胞功能障礙，研究氨氯地平修復其功能障礙的相關機制。

1 材料和方法

1.1 試劑 蛋白酶抑制劑、總RNA 分離試劑盒(Sigma-Aldrich 公司);cDNA 擴增試劑(Promega公司)。氨氯地平(Am)(LKT Laboratory)。MCP-1、VCAM-1、β-actin 等的抗體及二抗(Abcam公司);莫洛尼鼠蛋白病毒反轉錄酶(MMLV-RT)(Invitrogen 股份有限公司);硝酸纖維素膜(Milipore 公司);Western Blot 印跡化學發光試劑(Santa Cruz 公司)。

1.2 低密度脂蛋白(LDL)的離析與糖基化 血漿由健康志愿者的血液中分離。天然LDL(nLDL)利用超速離心法離析。非酶促糖基化LDL(AGE-LDL)的制備通過將LDL 在37 ℃無菌條件下、在含有抗氧化劑(1 mg/mL EDTA +1 μM BHT)的0.2M D(+)葡萄糖中孵育4 周得到［10］。

1.3 細胞培養及細胞分組 人臍靜脈內皮細胞(HEC)來自EA. hy926 細胞株(購自ATCC)。細胞在含有5 mM 葡萄糖和10%胎牛血清(FCS)的DMEM 培養基(Dulbecco's modified Eagle Medium)中培養。匯合時，將細胞置于含有0.2% FCS的DMEM 培養基中饑餓，之后將細胞分為3 組:①nLDL 組，在含有100 μg 蛋白/mL nLDL 的培養基中孵育24 h;②AGE-LDL 組，在含有100 μg 蛋白/mL AGE-LDL 的培養基中孵育24 h;③AGELDL +Am 組，在含有100 μg 蛋白/mL AGE-LDL+10 μM Am 的培養基中孵育24 h。24 h 后收集細胞及培養液。

1.4 MCP-1 及VCAM-1 基因表達的定量 分離總RNA，并利用MMLV-RT 反轉錄。利用MCP-1、VCAM-1 及β-actin 的特定引物應用實時PCR(美國應用生物系統公司StepOne Plus 系統)進行cDNA 擴增(引物序列見表1，引物合成:上海博尚生物技術有限公司)。擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測，并分析各組目的基因的OD 值。上述基因分別以nLDL 組細胞所測值的相對值表示。

表1 MCP-1、VCAM-1、β-actin 引物序列

1.5 培養基中MCP-1 蛋白的定量 收集三組培養液，分別通過Western Blot 檢測MCP-1 蛋白含量［11］。MCP-1 蛋白量用其與培養基中總蛋白的相對量表示，以任意單位(A.U.)表示。

1.6 統計分析 應用SPSS 13.0 統計軟件，數據用±s 表示，計量資料比較采用t 檢驗，P ＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 氨氯地平對MCP-1 基因的表達及MCP-1 蛋白分泌的影響與nLDL 比較，AGE-LDL 組MCP-1 mRNA 含量升高1 倍(1.00 ±0.05 升高至2.02 ±0.27，P ＜0.01)，在AGE-LDL 中加入Am后，測得MCP-1mRNA 值明顯下降(1.40 ±0.19，30%，P ＜0.01)。見圖1。對培養基中MCP-1 蛋白相對量的分析顯示，AGE-LDL 組MCP-1 的分泌明顯高于nLDL 組，且加入Am 后，MCP-1 的分泌量明顯下降(較AGE-LDL 組下降58%，P ＜0.01)。見圖2。

圖1 各組細胞相對nLDL 組細胞的MCP-1 基因表達水平的相對值

圖2 各組培養基MCP-1 蛋白相對培養基中總蛋白值

圖3 各組細胞相對nLDL 組細胞的VCAM-1 基因表達水平的相對值

2.2 氨氯地平對VCAM-1 基因表達的影響 與nLDL 相比，AGE-LDL 組VCAM-1 mRNA 表達明顯升高(1.00 ±0.03 升至1.24 ±0.07，P ＜0.05)。而AGE-LDL 中加入Am 后，VCAM-1 mRNA 的表達明顯下降(0.77±0.06，38%，P ＜0.05)。見圖3。

3 討論

糖尿病通常伴有血脂異常，血管并發癥是糖尿病主要的并發癥之一。脂代謝異常、高血糖、胰島素抵抗、糖基化血紅蛋白等在其發病過程中均起重要作用。晚期糖基化終末產物(AGEs)是指蛋白質、脂質或核酸等大分子在沒有酶參與的條件下，自發地與葡萄糖或其他還原單糖反應所生成的穩定共價物，該反應過程稱為非酶促糖基化反應(Maillard 反應)。AGEs 可通過直接或間接的方式對機體多個組織和器官產生病理作用。高糖、氧化應激等狀態下機體AGE 可形成加速，血清AGEs 濃度可明顯升高［12］。本實驗即利用AGE-LDL 模擬高糖及血脂異常環境，研究其對內皮功能的影響。

有研究表明，炎性因子MCP-1 可促進血液中單核細胞遷移至血管內膜，促發血管內膜炎性反應［13］。亦有研究表明，VCAM-1 是啟動動脈硬化早期炎癥反應和介導單核細胞遷移和滲透的關鍵步驟［14］。AGE 可通過激活NF-κB 誘發血管內膜炎性反應［15］。本研究顯示，AGE-LDL 可上調MCP-1 及VCAM-1 的表達，促進MCP-1 的分泌，從而誘導血管內膜炎癥反應的發生。

Ca2+是生物體內非常重要的信號轉導因子，主要作為細胞信使傳遞胞外信號，是多種受體激動后信息傳遞的中心環節，細胞質內Ca2+水平升高，可觸發細胞許多生命活動過程。You 等［16］研究指出，AGE 作用于內皮細胞后，能增加細胞內鈣離子含量，并通過Ca2+-NF-κB 途徑誘導內皮細胞炎癥反應。氨氯地平作為第三代鈣離子拮抗劑，已廣泛應用于高血壓患者的降壓治療當中［17-23］。本研究顯示，與AGE-LDL 比較，經Am + AGELDL 處理后的內皮細胞MCP-1 及VCAM-1 的表達明顯下降，MCP-1 的分泌亦明顯降低。表明氨氯地平可下調血管內皮細胞MCP-1 及VCAM-1基因的表達，在糖尿病合并動脈粥樣硬化的血管內皮功能障礙方面具有一定的修復及保護作用。

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