蛇床子素體外對(duì)人前列腺癌DU145 細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制

張 毅，佟笑竹，徐小嫚，張 萌，曲 丹，何 平*

前列腺癌是嚴(yán)重威脅老年男性健康的疾病，是老年男性最常見的惡性腫瘤之一［1-2］。目前藥物治療方法主要有化療、內(nèi)分泌治療以及中藥治療等［3］。但臨床治療效果不能令人滿意，因此，尋找對(duì)前列腺癌更有效的治療藥物尤為重要。蛇床子素是蛇床子果實(shí)中提取的一種天然化合物。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素具有抗心律失常、增強(qiáng)免疫功能、抗菌及抗病毒等多種藥理作用［4-5］，且在抗腫瘤方面的作用明顯，可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲等［6-10］。但蛇床子素對(duì)前列腺癌的抑制作用未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)就蛇床子素對(duì)人前列腺癌DU145 細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制進(jìn)行研究，以期為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌DU145 細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫;蛇床子素(純度≥98%)購自中國(guó)藥品生物制品檢定所，溶解于二甲基亞砜(DMSO)，配制成100 mmol/L 的儲(chǔ)存液，-20 ℃保存?zhèn)溆?RPMI-1640 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購自美國(guó)Hyclone 公司;胎牛血清購自天津索萊寶生物工程有限公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、DMSO 及Hoechst 33342 購自美國(guó)Sigma公司;AnnexinV/PI 雙染試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;甲醇、冰乙酸由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌DU145 細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基在37 ℃，飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

1.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將DU145 細(xì)胞制成1 ×105/mL 的細(xì)胞懸液，每孔100 μL 接種于96 孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)每個(gè)劑量設(shè)3 個(gè)平行孔。于37 ℃，飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，加系列稀釋含蛇床子素的培養(yǎng)基，使其終濃度依次為30、60、90、120 μmol/L。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)含RPMI-1640 全培養(yǎng)基的空照和未予藥物作用的陰性對(duì)照，24、48 h各測(cè)1 次指標(biāo)。方法為在各檢測(cè)時(shí)間前4 h，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。棄上清，每孔加DMSO 150 μL，振蕩混勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm 的每孔光密度值(OD 值)。計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率，抑制率=1-加藥組OD 值/對(duì)照組OD 值×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI 雙染法檢測(cè)蛇床子素誘導(dǎo)DU145 細(xì)胞凋亡 將DU145 細(xì)胞制成5 ×105/mL 的細(xì)胞懸液，每孔2 mL 接種于6 孔板中，于37 ℃，飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入蛇床子素，使各組蛇床子素的終濃度為0、30、90 μmol/L 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶消化、離心收集細(xì)胞。用500 μL 1 ×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×106/mL。在細(xì)胞懸浮液中加入5 μL AnnexinV-FITC 輕輕混勻，再加入5 μL PI 后輕輕混勻，避光孵育15 min，1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 熒光電子顯微鏡觀察DU145 細(xì)胞凋亡形態(tài) 將DU145 細(xì)胞制成5 ×105/mL 的細(xì)胞懸液，每孔2 mL 接種于6 孔板中，于37 ℃，飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入蛇床子素，使蛇床子素的終濃度為0、90 μmol/L 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清，冷PBS 洗2 次，冷風(fēng)吹干，固定液(甲醇與冰乙酸的體積比為3∶1)固定15 min，PBS再洗 1 次。加入 Hoechst 33342 熒光染料(5 mg/L)1 mL，37 ℃避光孵育15 min，于熒光顯微鏡下觀察、照相。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，兩組之間比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青藤堿對(duì)DU145 細(xì)胞體外增殖的抑制作用 MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的蛇床子素作用于DU145 細(xì)胞24 、48 h 后，細(xì)胞增殖水平明顯受到抑制。隨著濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，蛇床子素對(duì)DU145 細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，這種抑制效應(yīng)呈現(xiàn)明顯的時(shí)間劑量依賴性(P＜0.05)(見圖1)。

圖1 蛇床子素對(duì)人前列腺癌DU145 細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 流式細(xì)胞檢測(cè)蛇床子素誘導(dǎo)DU145 細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI 雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度蛇床子素作用于DU145 細(xì)胞24 h 后，隨著蛇床子素濃度的增加，早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例都逐漸增加，并呈劑量依賴性(見圖2)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)蛇床子素誘導(dǎo)DU145 細(xì)胞凋亡

2.3 熒光電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) Hoechst 33342 染色熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，90 μmol/L蛇床子素作用于DU145 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞核形態(tài)變化顯著，呈現(xiàn)核固縮、核碎裂等典型凋亡改變。而空白對(duì)照組無相應(yīng)改變，細(xì)胞核形態(tài)正常(見圖3)。

3 討論

本研究選取的藥物蛇床子素又名甲氧基歐芹酚或歐芹酚甲醚，是從傘形科植物成熟果實(shí)蛇床子中提取分離出的天然香豆素類化合物，其化學(xué)名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素。近年來，有關(guān)蛇床子素藥理作用的研究有了很大進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗心律失常、增強(qiáng)免疫功能、抗菌及抗病毒等多種藥理活性［4-7］。

圖3 熒光電子顯微鏡(Hoechst33342 染色400 ×)觀察細(xì)胞核形態(tài)變化

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素具有明顯抗腫瘤活性。Xu 等［6-7］研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素可以通過將細(xì)胞周期阻滯于G2/M 期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制肺腺癌A549 細(xì)胞增殖，其分子機(jī)制與調(diào)控PI3K/Akt 通路有關(guān);蛇床子素可以抑制A549 細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，其機(jī)制與抑制MMP-2、MMP-9 表達(dá)有關(guān)。Yang 等［8］報(bào)道，蛇床子素可以通過抑制MMP-2表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 和MDA-MB 231的侵襲。Hung 等［9］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素通過抑制c-Met/Akt/mTOR 通路，發(fā)揮其抑制乳腺癌MCF-7 細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的作用。Zhang 等［10］報(bào)道，蛇床子素抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G2/M 期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與抑制NF-kB活性相關(guān)。此外，蛇床子素還可誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡［11］，誘導(dǎo)白血病HL-60 細(xì)胞凋亡［12］，對(duì)肺癌細(xì)胞接種的荷瘤小鼠有抑制腫瘤生長(zhǎng)作用［13］。但蛇床子素對(duì)前列腺癌是否有抑制作用未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用人前列腺癌DU145 細(xì)胞為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛇床子素對(duì)DU145 細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并且有時(shí)間劑量依賴關(guān)系。蛇床子素可誘導(dǎo)DU145 細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡觀察到了細(xì)胞凋亡的形態(tài)，進(jìn)一步證實(shí)了蛇床子素的抗前列腺癌作用。

綜上所述，蛇床子素可以抑制前列腺癌DU145 細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究為蛇床子素在治療前列腺癌方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其詳細(xì)分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

［1］ Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008［J］. Int J Cancer，2010，127(12):2893-2917.

［2］ Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010［J］. CA Cancer J Clin，2010，60(5):277-300.

［3］ 鐔云輝，陳照彥.前列腺癌治療進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2010，23(4):531-535.

［4］ Zimecki M，Artym J，Cisowski W，et al. Immunomodulatory and anti-inflammatory activity of selected osthole derivatives［J］.Z Naturforsch C，2009，64(5-6):361-368.

［5］ Matsuda H，Tomohiro N，Ido Y，et al. Anti-allergic effects of cnidii monnieri fructus(dried fruits of Cnidium monnieri)and its major component，osthol［J］. Biol Pharm Bull，2002，25(6):809-812.

［6］ Xu X，Zhang Y，Qu D，et al.Osthole induces G2/M arrest and apoptosis in lung cancer A549 cells by modulating PI3K/Akt pathway［J］.J Exp Clin Cancer Res，2011，30(1):33.

［7］ Xu XM，Zhang Y，Qu D，et al. Osthole suppresses migration and invasion of A549 human lung cancer cells through inhibition of matrix metalloproteinase-2 and matrix metallopeptidase-9 in vitro［J］.Mol Med Report，2012，6(5):1018-1022.

［8］ Yang D，Gu T，Wang T，et al.Effects of osthole on migration and invasion in breast cancer cells［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2010，74(7):1430-1434.

［9］ Hung CM，Kuo DH，Chou CH，et al.Osthole suppresses hepatocyte growth factor(HGF)-induced epithelial-mesenchymal transition via repression of the c-Met/Akt/mTOR pathway in human breast cancer cells［J］. J Agric Food Chem，2011，59(17):9683-9690.

［10］ Zhang L，Jiang G，Yao F，et al.Growth inhibition and apoptosis induced by osthole，a natural coumarin，in hepatocellular carcinoma［J］.PLoS One，2012，7(5):e37865.

［11］ Chou SY，Hsu CS，Wang KT，et al.Antitumor effects of osthol from Cnidium monnieri:an in vitro and in vivo study［J］.Phytother Res，2007，21(3):226-230.

［12］ Yang LL，Wang MC，Chen LG，et al. Cytotoxic activity of coumarins from the fruits of Cnidium monnieri on leukemia cell lines［J］.Planta Med，2003，69(12):1091-1095.

［13］ 周俊，程維興，許永華，等.蛇床子素對(duì)肺腺癌、肺鱗癌生長(zhǎng)抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.癌變畸變突變，2002，14(4):231-233.