正交設計優化枳實中3 種二氫黃酮苷的提取工藝

尹明曉，張金杰，翁遠超，趙慶春*

枳實始載于《神農本草經》，為蕓香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培變種或甜橙(Citrus sinensis Osbeck)的干燥幼果，具有破氣消積、化痰散痞的功效［1］。本品的主要成分為二氫黃酮苷類。為了有效提取其有效成分，本實驗采用乙醇提取方法，用L9(34)正交表設計試驗，優化枳實中3 種二氫黃酮苷的最佳提取工藝。

1 材料與儀器

1.1 材料 枳實購于沈陽四方大藥房，經沈陽藥科大學教授孫啟時教授鑒定為蕓香科植物甜橙的干燥幼果。乙腈為色譜純;醋酸、磷酸均為分析純(國藥集團);水為5 次蒸餾水(試驗自制)。柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷均從枳實中分離得到，均通過核磁鑒定，純度＞98%，符合分析定量要求。

1.2 儀器 Waters 600 controller、Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector(美國waters 公司);十萬分之一分析天平(日本SHIMADZU AUW120D);數顯恒溫水浴鍋(丹瑞HH-D4);粉碎機(屹立)。

2 方法與結果

2.1 柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷對照品4.8 mg、新橙皮苷對照品4.5 mg、橙皮苷對照品6.0 mg，置50 mL 量瓶，加50%乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液備用。

2.1.2色譜條件色譜柱:Welchrom C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:乙腈-0.5%磷酸溶液(18 ∶72)［2］;檢測波長:283 nm;柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min。

2.1.3 供試品溶液的制備 取枳實粉末10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，加入10 倍量50%乙醇，回流提取1 次，每次1.5 h，合并濾液，水浴蒸干，分別用50%乙醇溶解，置10 mL 量瓶，定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，作為供試品溶液。

2.1.4 線性范圍的考察 精密吸取對照品溶液10、20、30、40、50、60、70 μL，分別定容至50 mL 量瓶，搖勻。吸取上述溶液10 μL 進樣，每份進樣3次，記錄色譜峰面積。以對照品溶液濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，3個峰的理論塔板數均＞5 000，分離度均＞1.5，符合試驗標準。見表1、圖1。

2.1.5 精密度實驗 精確吸取3 種黃酮苷標準品溶液各10 μL，連續進樣6 次，記錄色譜圖，計算峰面積RSD 分別為2.1%、1.7%、0.8%，表明精密度符合要求。

2.1.6 穩定性實驗 取枳實樣品，按“2.1.3”項方法處理，分別0、2、4、6、8、12、24 h測定，記錄色譜圖，計算峰面積RSD 分別為2.0%、1.8%、1.6%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

表1 枳實中柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的線性回歸方程

圖1 樣品液相色譜圖

2.1.7 重復性實驗取枳實粉末6 份，按“2.1.3”項方法處理，在上述色譜條件下測定，記錄色譜圖，計算峰面積RSD 分別為2.7%、2.5%、2.3%，結果表明，本方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率實驗 稱取枳實粉末10 份，每份1.0 g，精密稱定。其中1 份不加對照品，作為隨行對照;其余9 份中，3 份為1 組，分別加入高、中、低3 個濃度的柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷對照品，進樣10 μL。記錄色譜圖，加樣回收率分別為100.9%、102.2%、102.3%。RSD 分別為1.13%、1.10%、0.78%，符合試驗標準。

2.2 正交試驗篩選枳實中3 種二氫黃酮苷的提取工藝［3］

2.2.1 提取工藝中單因素的考察 ①乙醇濃度考察:取4 份枳實粉末各10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，分別加入30%、40%、50%、60%乙醇提取。結果表明，50%乙醇提取效果最好。②乙醇用量考察:取4 份枳實粉末各10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，分別加入8、10、12、14 倍量的50%乙醇。提取相同時間，結果表明，10 倍量體積的乙醇提取效果較好。③提取時間考察:取4 份枳實粉末各10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，分別加入10 倍量的50%乙醇。分別提取1、1.5、2、2.5 h，結果表明，1.5 h 的乙醇提取效果較好。④提取次數考察:取4 份枳實粉末各10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，分別加入10 倍量的50%乙醇。分別提取1、2、3 次，每次提取1.5 h。結果表明，提取2 次較好。

2.2.2 正交實驗設計 稱取枳實藥材10 g，以乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數為影響因素，根據預實驗的結果設定3 個水平，以1 g 藥材中所含有的柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的含量為指標，按照L9(34)正交表進行試驗［4］，見表2。

表2 正交實驗因素

2.2.3 結果 正交試驗結果、方差分析見表3、表4。由表3、表4 可見，根據綜合評價標準，A ＞(B =C)＞D。因此，最佳提取工藝為A2B1C2D1。即8 倍量的50%乙醇提取1 次，每次提取1.5 h。

表3 正交實驗設計表格

表4 方差分析結果

2.3 驗證試驗 按照上述優選工藝，提取3 批藥材，計算柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷含量(見表5)。

表5 驗證試驗結果

3 討論

本試驗對枳實中3 種主要有效成分—柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的提取工藝進行了優化。采用正交設計試驗的方法，確定了乙醇濃度、提取時間、提取次數以及乙醇用量4 個影響因素，確定了最佳提取工藝為8 倍量的50%乙醇提取1 次，每次提取時間為1.5 h。結果表明，該方法提取枳實中的3 種二氫黃酮苷類化合物，工藝簡單、提取率高、操作容易，為枳實的工業生產提供了合理的依據。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:化學工業出版社，2005:816-817.

［2］ 姜華，李軍，石任兵，等.HPLC 法測定枳實黃酮有效部位中3種二氫黃酮的含量［J］.中國藥房，2008，27(2):2127-2128.

［3］ 謝貞建，焦士蓉，唐鵬程，等.枳實總黃酮提取工藝的響應面法優化［J］.食品研究與開發，2009，30(7):41-44.

［4］ 胡靜，尚?；?，王陽，等.正交試驗優選枳實中辛弗林提取工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(13):22-23.