嬰幼兒食品和乳制品中維生素B12測定的探討

魯盛靜,田野

(1.北京市農林科學院植物營養與資源研究所，北京 100097；2.北京聯合智業質量檢驗有限公司，北京 100101)

引 言

根據國內外目前的相關資料，目前測定維生素B12主要有4種方法：比色法、原子吸收分光光度法、高效液相色譜法及微生物法。其中微生物法是通用方法，該法靈敏度很高，但由于該法操作關鍵點多，微生物生長周期長，成本高等問題而不能廣泛應用。但對于含量低，且低于儀器檢出限的維生素仍然需要微生物法進行測定，公職分析化學家協會(AOAC)和美國藥典(USP)以及中國國家標準GB5413.14—2010都將微生物法作為維生索Bb測定的主要方法和仲裁方法，儀器法作為輔助方法。微生物法的高靈敏度和可靠性已得到國際權威機構的認可。所以推廣微生物法很有意義。

1 維生素B12特性及功能

維生素B12是人體內每天需要量最少的一種，過量的維生素B12會產生毒副作用。據報道注射過量的維生素B12可出現哮喘、蕁麻疹、濕疹、面部浮腫、寒顫等過敏反應，也可能相發神經興奮、心前區痛和心悸。維生素B12攝入過多還可導到葉酸的缺乏［1］。尤其對嬰幼兒奶粉的控制量更為重要，在國標GB 10765-2010中明確規定一段奶粉維生素B12標準量為0.025～0.360 μg/100 kJ,較大嬰兒配方奶粉維生素B12量為≥0.04 μg/100 kJ［2］。

表1 維生素B12需求量［3］

2 微生物法與高效液相色譜法比較

根據國內目前的相關資料，測定維生素B12主要有微生物法［4］和高效液相色譜法［5］。 高效液相色譜法大都用于保健食品、藥品及維生素預混料等樣品，該類樣品一般維生素B12質量分數較高或基質簡單，易于檢測。

目前有關液相色譜法測定維生素B12方法中檢出限一般都不能滿足奶粉專用維生素添加劑的測定。如國家藥品標準中規定的方法［6］，測定液中要求在10 μg/mL以上；測定飼料添加劑時,測定液中要求在40 μg/mL左右。而奶粉專用復合維生素添加劑中的維生素B12質量分數一般為10 μg/g或更低(國標規定嬰幼兒配方奶粉中維生素B12質量分數≥0.8 μg/100 g,即維生素添加劑質量分數一般應在800 μg/100 g 以上)［7］，若稱取樣品量為10 g左右 (稱樣量過大樣品無法完全溶解及會影響色譜柱分離)，定容至50 mL時，測定液中維生素B12含量約為2 μg/mL；且許多樣品中的維生素B12質量分數低于10 μg/g,制備液甚至在1 μg/mL以下，所以用于測定此類樣品中維生素B12質量分數的方法必須達到一定的檢出限。另外在奶粉專用復合維生素添加劑中除含有10多種維生素外,還有其他雜質。這些組分質量分數遠高于維生素B12質量分數,要通過色譜柱進行有效分離并準確定量測定，在選擇合適的色譜柱的同時,還需研究相應的測定條件及樣品處理方法。因此，液相色譜法測定維生素B12有較明顯的局限性，對于乳制品中維生素B12的測定更為困難。

微生物法是測定如食品中維生素B12的通用方法，微生物是生長旺盛，繼代時間短，比表面積很大的生命體。微生物對環境的高度依賴性決定了微生物法的高度靈敏性。可測定出樣液中0.01 ng/mL的質量濃度。若認定一臺儀器，固定其工作狀態和測定條件，則該方法可消除因儀器而產生的一些誤差。

綜上分析，高效液相色譜HPLC測定的是跟維生素標準品具有相同化學結構的維生素，跟生物活性沒有直接關系，導致：①沒有生物活性的維生素被檢測；②具有生物活性但化學機構與標準品不同的維生素漏測，只有具有生活活性的維生素才能被人或者動物吸收利用。微生物法利用微生物對于某種維生素的特異性和靈敏性，測定的正是具有生物活性的一部分維生素。

3 實驗原理

利用萊士曼氏乳酸桿菌(Lactobacillus leichmannii)對維生素B12的特異性和靈敏性，定量測定出試樣中維生素B12的質量分數。在測定用培養基中供給除維生素B12以外的所有營養成分，這樣微生物生長產生的透光率就會同標準曲線工作液及未知待測溶液中維生素B12的質量分數相對應。以不同濃度標準溶液的透光率相對于各濃度水平標準物質的濃度繪制標準曲線，根據標準曲線即可計算出試樣中維生素B12的質量分數。

4 實 驗

4.1 儀器

具體參見標準GB5413.14—2010。試管和移液管處理：由于堿性的洗滌劑會對萊士曼氏乳酸桿菌的生長起到促進作用，所以如果洗刷不干凈的試管會讓菌種長的過于旺盛，導致實驗不成梯度，實驗失敗。試管內的油漬也會促進菌種的生長，所以所用到的玻璃器皿的清洗尤為重要，是實驗成敗的重要因素之一，也是很多實驗室最容易犯的錯誤之一，建議單獨使用固定試管。正確做法是硬玻璃測定管用洗滌劑進行清洗，，或用20%(體積分數)鹽酸浸泡處理，再用蒸餾水多次沖洗，再在200℃干熱2～3 h。其他必要的玻璃器皿可以用洗液直接清洗，沖洗干凈待用。介紹一種強酸氧化劑洗液:強酸氧化劑洗液是用重鉻酸甲(K2CrO7)和濃硫酸(H2SO4)配成。K2Cr2O7在酸性溶液中，有很強的氧化能力，對玻璃儀器又及少有侵蝕作用。所以這種洗液在實驗室內使用最廣泛[8]。

4.2 試劑

維生素B12標準品：分子式C63H88CoN14O14P，純度為99.8%，計算濃度時純度參與計算。

培養基：乳酸桿菌瓊脂培養基，乳酸桿菌肉湯培養基，維生素B12測定用培養基。

5 菌種復活與傳代

根據萊士曼氏乳酸桿菌(Lactobacillusleichmannii)ATCC7830的特點，該菌種生命力不強，在維生素B12斜面上存活時間比較短，需要定期傳代、作為工作菌種的一般儲存狀態。為了實驗數據穩定性和重復性好，菌種最好只使用2～5代，防止代數過多菌種變異或者污染導致特性減弱或引入雜菌影響實驗結果，菌種活力直接影響實驗成敗，要提出特別注意。菌種在斜面一般5～7 d就需要傳一代。維生素B12肉湯用于實驗前一天的增菌，不適宜用于菌種保藏。短期保藏可以用質量分數為30%甘油肉湯儲藏，冷凍干燥(脫脂乳洗脫冷凍干燥)保藏可以用于菌種的長期儲藏。也可以用成品的菌種保藏管長期保存［9］。表 2為不同培養基特點及用途。

表2 不同培養基特點及用途

6 標準液的制備

具體參見標準GB5413.14—2010。

在做稀釋時候可以根據實驗室具體情況另作調整，比如可以吸取2 mL到100 mL和200 mL容量瓶中，同樣制備成高濃度溶液的質量濃度為0.02 ng/mL；低質量濃度溶液的質量濃度為0.01 ng/mL。所有標準溶液要儲存于冰箱內,中間工作液保存期3個月，工作液臨用前配制。

7 樣品處理

稱一定量的樣品(含維生素B12約50～100 ng，一般奶粉樣品按最低限稱取，因為一般含量偏高，固體樣品要注意粉樣均勻，液體吸取時要用大肚移液管吸取，大肚移液管要清洗干凈不能掛壁，移取樣品時擦干大肚移液管外壁液體，防止取樣不精確。稱取時不能超過25 g最大稱取量，防止水解釋放不完全。加入10 mL緩沖溶液時要充分混勻之后再加入150 mL蒸餾水。內源性(天然)的維生素是和蛋白質結合存在的。必須經熱或酶分解成游離態才能被測定，提取目的就是釋放出維生素。幫助樣品中維生素B12水解時很好釋放。冷卻后調pH值至4.5±0.2，使得樣品中蛋白質沉淀，確保溶液澄清，溶液的渾濁對測吸光度影響很大，如果被測樣品無法澄清就做無菌空白試樣(只加培養基不加菌)，計算時減本底吸光度值。再用水定容至250 mL，過濾。移取濾液5 mL，加入水20～30 mL，調pH至6.8±0.2，此處調節pH值是保證維生素B12和萊士曼氏乳酸桿菌在pH中性中培養，用水定容至100 mL。最終溶液中維生素B12的質量濃度約在0.01～0.02 ng/mL。

水解后的樣品可以在冰箱內儲藏3 d左右，稀釋后的樣品不可以儲藏用于下次實驗。表3為標準系列試管編號及加樣量；表4為樣品試管編號及加樣量。

表3 標準系列試管編號及加樣量

表4 樣品試管編號及加樣量 mL

8 實驗過程

8.1 滅菌

系列和樣品的所有的試管蓋上試管帽，121℃滅菌5 min(商品培養基按標簽說明進行滅菌)。可將需要的維生素B12測定用培養基根據需要一同滅菌。滅菌時要保持試管間適當的間隙，維持空氣流通，盡量保證實驗條件一致。

8.2 菌懸液制備

將培養好的菌懸液置于離心機中離心，去上清液加入10 mL滅菌高純水混勻反復離心3～4次再加入10 mL滅菌高純水待用。

8.3 接種

將上述試管迅速冷卻至30℃以下，培養基冷卻至45℃左右，加菌量的控制很重要，決定了實驗的成敗，萊士曼氏乳酸桿菌從維生素B12斜面接到維生素B12肉湯后培養時間不適宜過長，一般過夜后第二天早上觀察菌量及時停止培養，以免菌種大量生長，造成老化，影響實驗比色結果。用滅菌的高純水洗脫菌3～4次，并用紫外分光光度計測試透光率，以生理鹽水做空白，透光率一般在60%～80%為宜，75%的透光率500 mL的培養基加菌0.5 mL，混勻培養基，用滅菌滴管向上述試管中各滴加5 mL培養基 (其中標準曲線管中空白1除外)，加菌也可以用移液槍加菌懸液。加菌量的控制和重要，如果菌量加多了培養24 h后系列和樣品生長濁度過高而導致不成梯度，無法比色而實驗失敗，或者導致不加菌空白渾濁，即使系列線性很好的情況下，也會使實驗數值便高。如果加菌量少了，培養24 h后系列和樣品生長濁度過低而需要繼續培養，延長實驗時間。

8.4 培養

將加完菌的試管用渦旋混合器混勻，放入恒溫培養箱內，36℃ ±1℃培養19～20 h，培養時要保持試管間適當的間隙，維持空氣流通，盡量保證實驗條件一致。能用搖床式培養更好，混勻幫助生長。20 h左右要隨時觀看比色濁度，再用渦旋混合器混勻幫助生長，隨時準備比色。

8.5 比色

最佳比色時間是系列最高濃度的透光率在30%左右，確保2 h之內透光率變化小于2%即可讀取數據，可以確保透光率拉開梯度，太低的透光率使系列拉不開導致斜率低。如果把握不好比色終點可多做幾根系列高濃度點，培養18 h后每隔一個小時比色一次判斷比色終點，當透光率梯度不明顯時可用吸光度值測定結果。

8.6 數據處理

根據樣品的透光率由計算公式求出相應質量分數，每支試管測得的濃度不得超過該平均值的±15%，超過者要舍去。符合該要求的管數少于所有的4個編號的待測液的總管數的2/3，用于計算試樣質量分數的數據是不充分的,需要重新檢驗。兩次實驗數據不得超過平均值的±10%。

9 結果與討論

9.1 標準系列

建議做3個平行，在取舍的時候選擇性和對比性更好，系列是決定實驗成敗的關鍵因素，長期實驗證明，同樣的樣品反復多次實驗，樣品透光率基本不會有大變動，變化的是系列本身，從而導致結果變化。樣品第一次做可以做兩個平行，找到合適的稱取量范圍之后再做3個平行來分析出數，這樣在保證實驗數據精準的前提下可以減少實驗成本。

9.2 回收率

吸取102 ng/mL的標準工作液1 mL作為質控樣和樣品做同樣前處理、水解、稀釋、加樣、加菌、培養、比色，一般回收率在95%左右。標準系列讀數(略)。

由質控樣讀數結果(略)，經計算指控樣質量濃度為100 ng/mL， 指控樣回收率為98%。

9.3 線性關系

以吸光度與質量繪制標準曲線，得回歸方程y=-711.2x+94.65,R=0.9944。結果表明，維生素B12對照品溶液在0.01～0.10 ng范圍內質量與吸收程度呈良好的線性關系。

9.4 精密度實驗

精取質量濃度為102 ng/mL的標品溶液在540 nm連續測定5次，測得維生素B12的平均吸光度為81.56，65.98，49.50，41.06。 RSD 值 為 0.01% ，0.01% ，0.03%，0.02%(n=5)。 RSD數值較小，說明該方法精密度好。

9.5 重復性實驗

精取同一質量濃度標準品102 ng/mL，分別按標準稀釋方法制備一式5份的供試品溶液 (可稱之為實驗室內部質控樣)，測定其質量濃度，計算得維生素B12的平均質量濃度為94.8 ng/mL，RSD值為0.07%(n=5)，說明該方法有較好的重復性。

10 結束語

綜上所述，雖然微生物測定法不易掌握，但經過實驗經驗歸納總結，實驗關鍵點控制，GB5413.14-2010方法精密度和重復性試驗結果良好，對于質量分數甚微的維生素測定、低于儀器最低檢出限的維生素測定、具有生物活性的維生素的檢測具有一定指導意義。

[1]李寧，黎海芪.維生素B12缺乏的研究進展 [J].國際兒科學雜志2009，36(2)188-190.

[2]中華人民共和國國家標準.食品安全國家標準嬰兒配方食品[S].標準號:GB10765-2010.

[3]中國營養學會.中國居民膳食營養素參考攝入量[M].北京：中國輕工業出版社，2008.

[4]中華人民共和國國家標準.食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定[S].標準號:GB5413.14-2010.

[5]劉娜,陳大舟,湯樺,等.嬰兒配方奶粉中8種水溶性維生素的高效液相色譜同時測定[J].分析測試學報,2008,27(4):408-411.

[6]國家藥品監督管理局.國家藥品標準.注射用多種維生素(9)[S].標準號WS1-XG-2002.

[7]中華人民共和國國家標準.嬰幼兒配方食品及嬰幼兒補充谷粉通用技術標準[S].標準號:GB10767-1997.

[8]夏玉宇，化學實驗室手冊[M].2版.北京：化學工業出版社，2008.

[9]沈萍.微生物學[M].北京：高等教育出版社，2001:19-20.