乳制品中非法保鮮劑硫氰酸鈉檢測方法的研究

蔡如繁，茹巧美，何晉浙

(浙江工業大學 生物與環境工程學院食品系,杭州310014)

0 引 言

乳制品是一種營養豐富，老少皆宜的產品，在我們的生活中不可或缺。自三聚氰胺事件之后，國家對于乳制品的安全問題格外重視。近來，衛生部發布《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》，公布一種乳制品非法保鮮劑，即硫氰酸鈉。硫氰酸鈉在牛奶或奶粉中摻入后可有效抑菌、保鮮。但硫氰酸鈉是毒害品，一般用于工業制造，人體少量的食入就會造成極大傷害。而且，目前尚無食品中硫氰酸鈉檢測的國家標準或行業標準[1]，是乳品質量安全的一大漏洞。因此，建立乳品非法保鮮劑的檢測分析方法，并對市場上常見品牌的乳品進行風險評估研究，對我國的奶業發展和人民身體健康具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

V-1800 PC型紫外分光光度計，Agilent 1260 Infinity高效液相色譜系統，ICS-2000離子色譜系統，配備電導檢測器，高速冷凍離心機，KQ5200ZE型數按超聲波清洗器，METTLER AE240電子分析天平，Millipore超純水發生器，RP柱。

1.2 原料與試劑

市售6種牛奶與6種奶粉品牌。

硫氰酸鈉儲備液(質量濃度1 000 mg/L)：準確稱取0.1 g硫氰酸鈉 (精確到0.0001)用純水定容到100 mL；硫氰酸鈉工作液：用純水將硫氰酸鈉儲備液逐級稀釋得到。

硝酸鐵溶液(質量濃度50 g/L)：稱取25 g Fe(NO3)·9H2O溶于200 mL水中，加入25 mL濃硝酸，用水定容到1 000 mL的容量瓶中；Triton-X-100溶液 (200 g/L)：稱取20 g Triton-X-100，用水定容到100 mL的容量瓶中。

乙腈(色譜純)；

濃度為0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7)：稱取3.5814 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)溶于500 mL容量瓶，1.5601 g磷酸二氫鈉 (NaH2PO4·2H2O) 溶于500 mL容量瓶，再將磷酸氫二鈉∶磷酸二氫鈉=500∶320按比例混勻，制的磷酸鹽緩沖液。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5.0 g奶粉或吸取5.0 mL牛奶于50 mL的具塞比色管，加入15 mL水，密塞振搖均勻，在70℃下超聲提取10 min，冷卻后加入25 mL乙腈[2]，再超聲20 min，最后用水定容到50 mL。然后至高速冷凍離心機中，4℃下15 000 r/min離心20 min，小心取出全部上清液，過0.45 μm的有機濾膜，待測。

1.3.2 紫外分光光度法

吸取5 mL經過前處理的奶粉樣品濾液，加入4 mL硝酸鐵溶液和4 mL Triton-X-100溶液，用水定容到25 mL，搖勻，暗處放置2 min后在465 nm下測定吸光值，以樣品空白做參比。根據標準曲線可得樣品中的硫氰酸鈉質量濃度[3]。另外，分光光度法不適合液奶的檢測。

1.3.3 液相色譜法

色譜柱：AgilentEclipseXDB-C18(4.6mm×150mm，5 μm)；流動相為磷酸鹽緩沖液∶乙腈=95∶5；流速為1 mL/min；紫外檢測波長為218 nm；柱溫為30℃；進樣量為10 μL。

在上述色譜條件下，對標準工作液、樣品溶液、空白溶液分別進樣測定，樣品濾液上機前要過0.22 μm的針式濾膜。根據標準曲線可得樣品中硫氰酸鈉的質量濃度。

1.3.4 離子色譜法

色譜柱：IonPac AS19分析柱 (4 mm×250 mm)和AG19保護住(4 mm×50 mm)；流動相：KOH溶液(由淋洗液發生器生成)，濃度為50 mmol/L等度淋洗；流速為1.00 mL/min；抑制電導檢測器：ASRS-300(4 mm)型抑制器，抑制電流 124 mA；柱溫為30℃；電導池溫度為35℃；進樣量為25 μL。

經過前處理的樣品溶液還要經過OnGuard RP柱(RP柱活化：用 5 mL甲醇沖洗，再用10 mL去離子水沖洗，放置20 min)[4]，棄去前面流出的1/3體積，收集余下的流出液，再進樣檢測。

在上述色譜條件下，對標準工作液、樣品溶液進樣測定，根據標準曲線可得樣品中硫氰酸鈉的質量濃度。

2 結果與分析

2.1 紫外分光光度法

2.1.1 顯色劑用量的確定

硫氰酸鈉能與三價鐵離子發生反應，生成硫氰酸鐵絡合離子[5]。試驗初期采用硫酸鐵氨作為顯色劑，但是硫酸鐵氨不穩定，而且硫酸鐵氨本底顏色較深。硝酸鐵本底顏色淺，可作為顯色劑使用，但顯色劑的加入量對顯色效果有明顯的影響，見表1。

表1 不同顯色劑用量對吸光值的影響

由表1可以看出，吸光值隨著顯色劑加入量的增大而增大，在顯色劑用量為4 mL的時候，曲線的斜率較大，之后趨于平緩，所以本試驗選用顯色劑的加入量為4 mL。

2.1.2 穩定劑用量的確定

在檢測過程中發現，樣品的吸光值會隨著時間變化呈下降趨勢，可能是由于生成的硫氰酸鐵顏色不穩定，因此使用Triton-X-100溶液作為顯色穩定劑，而穩定劑的用量對實驗結果也有明顯的影響，見表2。

表2 不同穩定劑用量對吸光值的影響

由表2可以看出，分別在5，30和60 min測量吸光值，當Triton-X-100溶液加入量為4 mL的時候，吸光值變化最小，越靠近4 mL變化也越小。因此選擇穩定劑的加入量為4 mL。

2.1.3 標準曲線的繪制

吸取硫氰酸鈉工作液(質量濃度100 mg/L)0，0.25，0.5，0.75，1.0 mL于50 mL的容量瓶中， 加入4 mL硝酸鐵溶液，再加入4 mL的Triton-X-100溶液，最后用純水定容，搖勻。暗處放置2 min，以零號管試劑空白做參比，在465 nm下測定吸光度。以吸光度(Y)對硫氰酸鈉濃度(x)得到線性回歸方程Y=0.0386x+0.0002,R2=0.9995，標準曲線如圖1所示。

2.1.4 檢測限、精密度與回收率測量

按上述方法，對空白溶液連續進行11次測量，求出其標準偏差S=0.10，以3倍的標準偏差得出本方法的最低檢測限(LOD)為0.3 mg/L。

對質量濃度為1.0 mg/L的標準溶液進行7次重復測量，計算相對標準偏差(RSD)為3.70%。

為了研究檢測方法的可靠性，對空白樣品進行加標回收實驗。稱取空白樣品各5 g，然后分別加入質量濃度為100 mg/L硫氰酸鈉工作液0.75，2.5，5 mL，按上述前處理方法處理，然后進行加標回收實驗，回收率可達99.05%～107.5%，實驗結果如表3所示。

表3 硫氰酸鈉加標回收檢測結果

2.2 液相色譜法

2.2.1 流動相的選擇

硫氰酸鈉在水中電離成硫氰酸根離子，而硫氰酸根是帶電的強極性物質。試驗初期采用磷酸-三乙胺組成的緩沖液體系[6]，但效果不是很理想，保留時間會發生偏移。后來采用磷酸鹽緩沖液(pH=7)，同時采用乙腈作為有機相[7]，取得較好的峰型和系統適應性參數。

2.2.2 色譜柱的選擇

對于色譜柱的選擇，選用了Agilent Eclipse XDBC18柱和Trigerkin ODS3柱進行比較。硫氰酸根在ODS柱的出峰時間為3.58 min，在C18柱的出峰時間為1.75 min。但采用ODS柱的標準溶液在出峰后會有一個向下的趨勢，而C18柱峰型良好，因此選用C18色譜柱，典型奶粉樣品圖見圖2。

2.2.3 標準曲線繪制

精密量取硫氰酸鈉儲備液，逐級稀釋得到質量濃度為100，50，10，5，1 mg/L的硫氰酸鈉標準工作液，然后在上述色譜條件下上機測定，每個質量濃度測定3次，記錄色譜峰面積均值，以峰面積(A)對標準工作液濃度(C)得到線性回歸方程，A=16.153C+1.9812，R2=0.9999。結果表明，該方法進樣質量濃度在1～100 mg/L范圍內線性良好。質量濃度10 mg/L的標準工作液的色譜圖如圖3所示。

2.2.4 檢測限、精密度與回收率測量

在上述色譜條件下，對空白溶液連續進行11次測量，求出其標準偏差S=0.063，以3倍的標準偏差得出最低檢出限(LOD)為0.2 mg/L。

對質量濃度為5 mg/L標準工作液進行7次重復測量，得出相對標準偏差RSD為1.31%。

為了研究方法的可靠性，對空白樣品進行加標回收實驗。分別在空白樣品中添加5 mL質量濃度為3，5，10，50 mg/L的標準工作液，經過前處理后，按上述色譜條件進行檢測，回收率達到83%～99.06%，結果如表4所示。

表4 硫氰酸鈉加標回收檢測結果

2.3 離子色譜法

2.3.1 色譜柱的選擇

硫氰酸根是疏水性較強的陰離子，在普通的陰離子柱上保留時間長、易拖尾且會出現峰型不對稱的情況，因此需要選擇親水性強的陰離子色譜柱。本研究將IonPac AS16、SH-Anion-1和IonPac AS19陰離子色譜柱進行了比較，發現IonPac AS19對于硫氰酸根分離時間短、峰型對稱且分離度高，效果非常理想。

2.3.2 淋洗液濃度的選擇

由于硫氰酸根屬于疏水性陰離子，因此在色譜柱上保留時間較長，一般情況下需要濃度較高且洗脫能力較強的淋洗液進行淋洗。固定流速對淋洗液的濃度進行考究，發現隨著淋洗液濃度的增大，硫氰酸鈉保留時間縮短，且峰型拖尾狀況得到改善。當設定淋洗液濃度為30 mmol/L的時候，出峰時間約為25 min，當淋洗液濃度增大到50 mmol/L的時候，出峰時間提前到約11 min，且峰型良好，典型奶粉樣品圖見圖4，因此選用50 mmol/L的KOH進行等度淋洗[8]。

2.3.3 標準曲線繪制

將硫氰酸鈉儲備液逐級稀釋得到2，1.5，1，0.5，0.1，0.05 mg/L的硫氰酸鈉標準工作液，在上述色譜條件下直接上機測定，每個濃度測定3次，記錄色譜峰面積均值，以峰面積(A)對標準工作液質量濃度(ρ)得到線性回歸方程，A=0.0615ρ-0.0003，R2=0.9999。 結果表明，該方法進樣質量濃度在0.05～2 mg/L范圍內線性良好。質量濃度1 mg/L的標準工作液的色譜如圖5所示。

2.3.4 測量結果

在上述色譜條件下，將標準溶液進樣，以3倍信噪比(S/N=3)計算，得出最低檢測限為0.05 mg/L。

對質量濃度0.5 mg/L的標準溶液進行7次重復測量，得出相對標準偏差RSD為0.615%。

同樣對空白樣品進行加標回收實驗。在空白樣品中添加5mL質量濃度為1，5，10 mg/L的標準工作液，經過前處理后，按上述色譜條件進行檢測，回收率達到81.7%～99.13%，結果如表5所示。

表5 硫氰酸鈉加標回收檢測結果

2.4 樣品檢測比較與討論

采用本文三個方法對市場上不同品牌的6個奶粉樣品和6個液奶樣品進行檢測，每個樣品重復三次，取平均值。其測定結果相近且樣品加標回收實驗結果理想，典型奶粉樣品的加標結果如表6所示。

表6 典型奶粉樣品加標結果對比

結果表明，紫外分光光度法的檢測限為0.3 mg/L，當加標量為0.3 mg/L時，空白回收率可達到102.6%；當加標量為1 mg/L時，空白回收率為107.5%，但樣品加標回收率只有95.31%。說明低質量濃度檢測時紫外分光光度法對樣品結果干擾較大，不適合質量濃度太低的樣品檢測，而且紫外分光光度法由于在樣品分析過程中會出現渾濁情況影響實驗結果，所以不適用于液奶的測定，對于奶粉測定結果良好。

液相色譜法的檢測限為0.2 mg/L，當加標量為0.3 mg/L時，空白回收率僅為80.33%，當加標量為1 mg/L時，空白回收率達到97.69%，樣品加標回收率為102.15%，當加標量為5 mg/L時，空白回收率達到99.06%。

離子色譜法的檢測限為0.05 mg/L，當加標量為0.1 mg/L時，空白回收率僅僅只有81.7%，當加標量為1 mg/L時，空白回收率達到99.13%，樣品回收率可達到101.1%。液相色譜和離子色譜對于樣品檢測結果干擾都比較小，而離子色譜更適合于低濃度樣品檢測。

因此，各個方法都具有良好的適用性和實用性，可以根據不同的需求加以選擇。另外，由于環境污染等原因，乳制品中會含有痕量硫氰酸根本底，其含量因品種、個體、環境等因素而存在差異[9]。因此，選用有品牌保證的乳制品將降低硫氰酸鈉攝入污染的風險。

3 結 論

本文建立了奶粉和牛奶中硫氰酸鈉的分析檢測方法，重點比較了分光光度法、液相色譜法和離子色譜法對于檢測乳品中硫氰酸鈉的檢測限、精密度以及回收率。

結果表明，低質量濃度的回收率要低一些，因此對硫氰酸鈉的分析結果相對誤差要大一些。紫外分光光度法僅適合奶粉的檢測，但不適合低濃度奶粉樣品的檢測，相對來說誤差要大。而液相色譜和離子色譜對于樣品檢測干擾較小，且離子色譜對于低濃度的樣品檢測結果更加可靠。

因此，對于一些資金少、儀器操作人員不夠專業的小型奶粉企業可以采用紫外分光光度法，此設備價格合理，而且操作簡單、實驗時間短，很適合在各奶粉制品企業推廣；液相色譜法檢測限低，應用范圍廣泛，適用于實驗室以及檢測單位；離子色譜法檢測限更低，儀器更加靈敏，但設備也比較昂貴，推廣范圍不是很廣，因此主要適用于各個研究院以及檢測單位的微量物質檢測。

[1]GB2760-2011,食品添加劑使用標準[S].北京：中國標準出版社，2011.

[2]冼燕萍,郭新東,羅海英等.氣象色譜-質譜法測定奶粉中三聚氰胺及其同系物[J].食品與發酵工業,2009,35(7):143-145.

[3]王厚德,楊彥功,丁銳.分光光度法測定腈綸中微量硫氰酸根[J].合成纖維工業,2004,27(5):60-61.

[4]林立,王海波,韓春霞.離子色譜法測定液態奶中的硫氰酸根[J].食品工程,2010(09):156-158.

[5]李衛群,單勝艷,朱慧.分光光度法測定乳與乳制品中硫氰酸鈉的含量[J].中國食品添加劑,2010(03):240-243.

[6]吳劍平,顧欣,李丹妮,等.高效液相色譜法檢測牛奶中硫氰酸鈉質量濃度[J].中國乳品工業,2011,39(7):44-46.

[7]史燁弘,石欲容.超高速液相色譜測定奶粉中的三聚氰胺[J].分析科學學報,2009,25(2):214-216.

[8]高勇興,鄭小平，王建軍.離子色譜法測定乳中硫氰酸鈉的不確定度評定研究[J].乳業科學與技術,2011(2):65-68.

[9]張水峰,林珍珍,陳小珍,等.基于離子色譜/電導檢測的全脂奶粉中硫氰酸鹽污染物的測定及前處理方法研究 [J].分析測試學報,2012,31(1):85-89.