生物有機肥對香蕉枯萎病及根系分泌物的影響

趙蘭鳳，胡偉，劉小鋒，張亮，李華興

華南農業大學資源環境學院，廣東 廣州 510642

根系分泌物是植物與外界環境進行物質交流的重要媒介, 是構成植物不同根系微生態環境特征的主要物質之一。因此，研究根系分泌物對于進一步明確植物的生理活動規律及其與環境之間的關系具有重要的理論和實際意義[1]。植物根系分泌物作為寄主自身抗病性的第一階段(侵染前階段)起著不可忽視的作用。Larkin[2]在研究連種西瓜對枯萎菌及根際微生物群落的影響時，發現在連種抗病品種的田塊中，即便加入中等量的病原菌和種植感病品種，發病率也不會很高，而在種植感病品種的田塊中仍保持很高的發病率。也有研究表明，小麥根系分泌物可以明顯控制病原菌引起的全蝕病和粉霉病等病害[3], 水葫蘆根系分泌物能抑制金黃色葡萄球菌的生長[4]。目前國內外有關環境脅迫下植物根系分泌物的研究主要集中在根系分泌物的種類和數量、分泌物與環境因子的相互聯系以及植物體的響應上，雖然也有一些關于植物土傳病害與根系分泌物關系方面的研究報道[5-7]，而施用生物有機肥防治香蕉枯萎病與根系分泌物的關系研究還鮮見報道。生物有機肥的施用作為防治香蕉枯萎病的有效措施之一[8-9]，無疑會改變根系分泌物的數量和組成，進而影響其防病效果。深入研究生物有機肥對香蕉根系分泌物組成及活性物質影響，對于探討生物有機肥的抗病機制具有重要意義。本研究通過盆栽試驗和離位溶液培養法研究了生物有機肥對香蕉枯萎病及香蕉根系分泌物的影響，試圖探討生物有機肥在植物-土壤-微生物三者之間的作用及其防病機理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤

采自華南農業大學農場由赤紅壤發育而成的水稻土。其主要理化性質為：質地為輕壤土；w(有機質)=12.1 g·kg-1；pH值5.98；w(堿解N)、w(有效P)和w(速效K)分別為50.0、46.0和143.1 mg·kg-1。測定方法參照《土壤農業化學分析方法》[10]。

表1 供試肥料的基本性質 Table 1 Basic characteristics of two fertilizers

1.1.2 供試肥料

供試肥料及其基本性質如表1所示。

1.1.3 供試作物

香蕉：巴西焦(Musa acuminata AAA Cavendish cv. Brazil)，營養杯組培苗，廣東省農業科學院果樹研究所提供。

1.1.4 病原菌 尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種Fusarium oxysopoyum f. sp. cubence race 4 (Foc4)。

1.1.5 生物有機肥料中添加菌種

解淀粉芽孢桿菌(AF11b，B. amyloliquefaciens)，由本試驗室篩選、分離并鑒定，對香蕉枯萎病病原菌FOC4有較強的拮抗能力。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

試驗采用盆栽的方式，2011年5月在資源環境學院網室中進行。試驗共設3個處理，分別為不施肥處理(CK)、施有機肥處理(OF)和施生物有機肥處理(BOF)。每個處理設20個重復，共60盆。

每盆裝風干土(過3 mm篩)5 kg，生物有機肥和有機肥施用量為8 g·kg-1土，全部作為底肥與土壤混勻。土壤澆水平衡5 d后移栽香蕉苗，選擇生長大小一致香蕉苗移植，每盆種植1株香蕉苗，在移栽的同時采用灌根法接種病原菌，病原菌菌液中孢子濃度為105mL-1，每盆澆20 mL。觀察香蕉生長和枯萎病發生情況，生長30 d后收獲蕉苗，觀察地上部莖、葉黃化和枯萎情況，切開根部記錄褐變程度。香蕉枯萎病病情指數和防病效果計算參考相關文獻[11]。

1.2.2 根系分泌物提取

根系分泌物收集采用離位溶液培養法[12-13]：將盆栽中的蕉苗從土壤中拔出，先用自來水沖洗3～5次，洗掉附著的土粒，之后用超純水沖洗2～3次。將蕉苗置入50 mL 5 mmol·L-1氯化鈣溶液中避光收集根系分泌物，每4株放入一個收集瓶中。連續收集6 h，慢速過濾(0.45 μm的微孔濾膜)。將收集到的根系分泌物定容到50 mL，取35 mL濾液真空冷凍干燥至干，加0.5 mL去離子水溶解，用于分析氨基酸。取15 mL濾液真空冷凍干燥至干，加1 mL去離子水溶解，用于分析低分子量有機酸。

1.2.3 根系分泌物中有機酸和氨基酸測定

（1）氨基酸組分測定：用日本L-8800氨基酸自動分析儀測定。

（3）有機酸類型和質量濃度采用高效液相色譜測定。安捷倫LC1100液相色譜儀（美國產），流動相：5 mmol·L-1H2SO4，流速：0.5 mL·min-1，進樣量：10 μL，檢測波長：210 nm。

1.2.4 數據分析

試驗數據用Excel 2003和DPS 7.05軟件處理，顯著性水平采用Duncun’s新復極差法分析。

2 結果與分析

2.1 生物有機肥對香蕉枯萎病的防治效果

接種香蕉枯萎病菌10 d后，不施肥處理(CK)最先開始發病，有機肥處理(OF)和生物有機肥處理(BOF)推遲香蕉枯萎病的發生。CK發病明顯，而且發病株數最多，OF次之，種植30 d時病情指數如圖1所示，BOF和OF防病效果分別達到55.4%和28.5%。說明施生物有機肥和有機肥可顯著降低香蕉枯萎病的發病率。

圖1 不同處理對香蕉枯萎病病情指數影響 Fig.1 Influence of different treatments on banana wilt disease index

2.2 生物有機肥對根系分泌物中有機酸質量濃度的影響

從香蕉根系分泌物中的有機酸結果(表2)可以看出，香蕉根系分泌物中包括3種低分子量有機酸，其中草酸質量濃度最高，蘋果酸質量濃度次之，與張志紅[11]測定結果相似。OF和BOF處理根系分泌物中草酸和反丁烯二酸質量濃度顯著高于CK，蘋果酸質量濃度則是CK和OF顯著高于BOF，反丁烯二酸質量濃度甚微，變化趨勢與草酸相似，且OF處理顯著高于BOF處理。影響有機酸總量的主要有機酸為草酸，不同處理根系分泌物的有機酸質量濃度為OF＞BOF＞CK，差異均達到顯著水平。上述結果表明，施肥可顯著影響根系分泌物中有機酸的質量濃度。與OF處理相比，BOF顯著降低了根系分泌物中有機酸質量濃度，表明生物有機肥中添加的功能菌對于降低根系分泌物中有機酸質量濃度具有顯著的作用。本研究結果與張志紅[13]等測定結果相似，研究表明，施用BOF香蕉根系分泌物中低分子量有機酸質量濃度降低，且有機酸質量濃度與防病效果變化呈相反趨勢[14-15]。

表2 不同處理根系分泌物中有機酸質量濃度 Table 2 The contents of organic acids in root exudates in different treatments mg·L-1

2.3 生物有機肥對根系分泌物中氨基酸質量濃度的影響

表3 不同處理根系分泌物中氨基酸質量濃度 Table 3 The contents of amino acids in root exudates in different treatments μg·L-1

從表3可以看出，施肥對根系分泌物中氨基酸的質量濃度和種類均有影響。BOF處理中氨基酸種類和總量最多，OF次之。施肥處理的磷酸絲氨酸、a-氨基丁酸和γ-氨基丁酸等17類氨基酸質量濃度均高于CK處理，牛磺酸、瓜氨酸、3-甲基-組氨酸和鵝肌肽質量濃度則相反，表明施用BOF和OF增加了氨基酸的種類和總量。BOF處理中γ-氨基丁酸、β-丙氨酸、a-氨基丁酸、谷氨酸、肌肽、天冬氨酸和磷酸絲氨酸質量濃度均顯著高于OF；BOF根系分泌物中主要氨基酸有磷酸絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、γ-氨基丁酸、乙醇氨和肌肽，其中磷酸絲氨酸和γ-氨基丁酸質量濃度顯著高于OF。以上結果表明，施用BOF后明顯提高根系分泌物中氨基酸質量濃度，說明BOF中添加的拮抗菌對根系分泌物中氨基酸的質量濃度有顯著影響。

為明確香蕉根系分泌物中氨基酸組分與枯萎病抗性之間的關系，對根系分泌物中氨基酸組分與香蕉枯萎病的重要抗病性指標—病情指數—進行相關性分析(表3)，結果表明，香蕉病情指數與磷酸絲氨酸、絲氨酸、異亮氨酸質量濃度呈顯著負相關，與鵝肌肽呈極顯著正相關；與牛磺酸、胱氨酸、羥賴氨酸、3-甲基-組氨酸質量濃度呈正相關，與天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、a-氨基丁酸、亮氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、賴氨酸質量濃度呈負相關，相關系數均大于0.85，但未達到顯著相關水平。

3 討論

對多種土傳病害的研究結果表明，根系分泌物的細小變化都會導致包括土壤病原菌在內的根際微生物區系的極大變化[16-17]，它是聯系植物和根際土壤微生物的重要媒介[18]。已有研究[19]表明，不同植物根系分泌物的氨基酸種類與數量有明顯差異。張俊英等[20]研究大豆根系分泌物中氨基酸對根腐病菌生長的影響時發現，感病大豆品種根系分泌的主要氨基酸為精氨酸，抗病大豆品種根系分泌的氨基酸主要為天冬氨酸。潘凱和吳鳳芝[21]研究表明，根系分泌物中總氨基酸質量濃度隨品種抗性的增加而降低，精氨酸、絲氨酸和賴氨酸的質量濃度與品種對枯萎病的病情指數呈負相關。韓麗梅等[22]研究結果表明，抗病品種根系分泌物中精氨酸比感病品種高1.02倍，感病品種根系分泌物氨基酸組分則對大豆根腐病病菌具有顯著的促進作用。有研究結果表明，不同大豆品種根系分泌的有機酸種類多少存在差異，而且同種有機酸的分泌量也因品種而異, 表現為感病品種的數量高于抗病品種[14]。這些研究結果[17,23]表明，根系分泌物與抗病性的關系主要體現在根系分泌物成分對根際微生物的影響。根系分泌物是影響土壤中病原菌生長繁殖的重要因素，與土傳病害密切相關。本研究結果表明，生物有機肥不僅為植物提供了大量養分且改善了微生態環境[8]，還促進了植物的生長并提高了植物的抗病性，這與根系分泌物的改變有密切關系。由此可見，根系分泌物在植物的抗病作用中起著不可低估的作用。生物有機肥可減少香蕉枯萎病發生，與其影響香蕉根系分泌物有關，這為香蕉枯萎病減輕的原因提供了一定理論依據。但還應深入研究有差異表達的氨基酸和有機酸在對香蕉枯萎病病原菌生長的影響，以進一步明確生物有機肥防治香蕉枯萎病的機制。

已在相關研究[20-21]中驗證了絲氨酸、精氨酸對黃瓜枯萎病病菌的生長發育有顯著的抑制作用，而苯丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和丙氨酸對黃瓜枯萎病病菌的生長發育有明顯的促進作用。本研究所得的相關性分析結果能否作為香蕉枯萎病抗性的鑒定指標，需要進一步檢驗。

4 結論

綜上所述，本試驗可以得出以下幾點結論：

（1）生物有機肥和有機肥可以有效防治香蕉枯萎病，防病效果分別達到55.4%和28.5%。

（2）生物有機肥比有機肥更明顯降低了各低分子量有機酸質量濃度，且顯著降低了有機酸總量質量濃度。

（3）生物有機肥和有機肥的施用都提高了根系分泌物中氨基酸的總量和種類，但生物有機肥的效果更顯著。

（4）香蕉枯萎病病情指數與磷酸絲氨酸、絲氨酸、異亮氨酸質量濃度呈顯著負相關，與鵝肌肽質量濃度呈極顯著正相關。

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