高效液相色譜－串聯質譜法測定人尿液中5種酚類內分泌干擾物

夏同偉，劉良坡，張文靜，申河清

(1．中國地質大學(武漢) 環境學院，湖北 武漢 430074;2．中國科學院 城市環境研究所，福建 廈門 361021;3．廈門大學 海洋與地球學院，福建 廈門 361005)

環境內分泌干擾物(Endocrine disrupting chemicals，EDCs)指一些外源性物質，它們會導致未受損傷的有機體發生逆向健康影響，或使有機體后代的內分泌功能發生改變。EDCs具有生殖發育毒性，有些還具有持久性和生物累積性［1］。生物檢測結果表明人體的尿液、乳汁、血液和精液等體液及組織(如胎盤)中均含有雙酚 A(BPA)［2－7］和三氯生(TCS)［8－11］。BPA 對大鼠和小鼠具有發育毒性［12］，并且能干擾雄性生殖活動的某些機制，影響機體的免疫功能［13］。TCS能在各種生物體內累積和富集，且能夠誘發DNA損傷，具有遺傳毒性［14］。炔雌酮(EE2)、雌酮(E1)、雌二醇(E2)屬于類固醇類環境內分泌干擾物，具有更強的內分泌干擾能力［15－17］，其中，E1是E2在體內的主要代謝產物，EE2是人工合成的雌激素，具有極強的雌激素活性，且具有生物蓄積性［18－20］。

圖1 5種酚類化合物的結構式Fig.1 Chemical structures of five phenolic endocrine disrupting chemicals(EDCs)

目前檢測水環境中BPA、TCS、E1、E2和EE2的方法已較為成熟［21－22］。配備通用電噴霧離子源的高效液相色譜－串聯質譜(HPLC－ESI MS/MS)技術具有較高的靈敏度、選擇性和重現性，可確保復雜基質中目標分析物的準確定量，也是目前分析環境內分泌干擾物的常用檢測方法［14，23］。但鮮有采用HPLCESI MS/MS技術同時測定人尿液中這5種污染物的相關文獻報道。本研究運用液－液萃取的前處理方法，建立了HPLC－ESI MS/MS結合穩定性同位素稀釋的分析技術，并將其應用于成人尿液中BPA、TCS、E1、E2和EE25種酚類化合物的含量測定(化學結構式見圖1)，同時對成人尿液中上述酚類化合物的暴露情況作了初步評價。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(日本島津);Applied Biosystems/MSD SCIEX質譜儀(美國應用生物系統公司);氮吹儀(天津市恒奧科技發展有限公司);渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);Mikro22k離心機(德國Hettich公司);超純水裝置(美國Pall公司)。

標準品:BPA(美國AccuStandard標準品公司);TCS和E1(純度均＞98%，美國Sigma－Aldrich公司);E2和EE2(德國Dr.Ehrenstorfer化學標準品公司);3種定量內標溶液為13C12BPA、13C12TCS(Cambridge Isotope Laboratories Ins，USA)和 E2－ D4(C/D/N Isotopes，Inc，Pointe － Claire，Quebec，Canada);E1、E2和EE2用E2－D4作為內標進行定量。乙腈、甲醇、正己烷、丙酮(色譜純，美國Honeywell公司);甲酸(分析純，中國上海試劑總廠);超純水(Cascada TM AN，美國Pall公司)。

1.2 實驗條件

1.2.1 質譜條件 離子源:電噴霧離子源(ESI+);檢測方式:多反應監測(MRM);離子源溫度:450℃;離子噴霧電壓:4 500 V;氣簾氣:10.0 psi;碰撞活化解離:中度。5種酚類化合物及內標物的質譜參數見表1。

表1 5種酚類化合物及內標物的質譜參數Table 1 Optimized parameters of five EDCs and internal standard substances

1.2.2 色譜條件 色譜柱:Phenomenex Kinetex C18(3 μm，100 mm×4.6 mm i.d．);流動相:0.1%甲酸水溶液(A)－甲醇(B)，線性梯度洗脫:0～5 min，由55%B線性變為95%B，然后保持5 min，最后6 min由95%B線性降至55%B;柱溫:35℃;進樣體積:20 μL;洗脫流速:0.6 mL/min。

1.3 樣品處理

1.3.1 酶 解 將儲存于－80℃的尿液自然解凍，準確移取1 mL尿液于15 mL試管中，依次加入20 μL 5 μg/L的定量內標溶液和1 mL pH 4.5的NaAc－HAc(0.15 mol/L)緩沖溶液以及10 μL的葡萄糖酸(150 units/mL的β-葡萄糖酸酶+4.2 units/mL的硫酸酯酶)，混合均勻，37℃條件下酶解2 h。

1.3.2 衍 生 酶解后的尿樣采用液－液萃取法提取目標物，每次加3 mL正己烷，萃取2次，合并正己烷萃取液，氮氣吹干后，依次加入0.5 mL丙酮、100 μL 1 mg/L溶解于丙酮的丹磺酰氯，以及100 μL pH 10.5的Na2CO3(0.1 mol/L)緩沖溶液，混合均勻，50℃溫浴30 min進行衍生反應。衍生后，用正己烷再次萃取，每次加3 mL，萃取2次，離心分層，合并正己烷萃取液，氮氣吹干;用甲醇定容至200 μL;7 000 r/min離心或過膜，收集上清液，待HPLC－ESI MS/MS分析。

1.4 定性與定量分析

以相對保留時間和被測物相應的監測離子的豐度進行定性分析。分別將系列標準溶液和試樣注入HPLC－MS/MS系統，記錄5種酚類化合物的峰面積以及相應的同位素的峰面積。利用1.5 Version analyst software軟件建立的定量分析方法，以各系列標準液的進樣濃度與對應的內標峰面積比繪制線性定量曲線，根據定量分析軟件進行定量分析。

1.5 質量控制與保證(QA/QC)

為保證測定結果的準確性，每批14個樣品，包含2個方法空白和4個質量控制(兩個低濃度和兩個高濃度)，實際樣品的含量扣除空白值。樣品處理前均加入同位素內標。空白加標進行回收率實驗，測定結果進行回收率校正。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的選擇

參考相關文獻，本實驗選擇正己烷作提取溶劑，采用液－液萃取法提取，取得了較好的效果。由于所研究酚類化合物在尿液中主要以葡萄糖醛苷或硫酸芳酯結合的不同形式存在，所以需要對樣品進行酶解［24］，將待測目標物從其共軛化合物中完全釋放出來。比較了加入不同單位的酶的效果，發現加入10 μL葡萄糖酸(150 units/mL的β-葡萄糖酸酶+4.2 units/mL的硫酸酯酶)后可使目標化合物從其共軛化合物中完全釋放。由于尿液中目標分析物的含量很低(μg/L級)，為了提高液相色譜－質譜的檢測靈敏度和準確度，采用丹磺酰氯［25］對待測物進行衍生化處理。考察了加入不同體積(10、50、100、150 μL)質量濃度為1 g/L的丹磺酰氯作衍生劑時對目標物強度的影響，結果顯示，目標物的信號強度隨著丹磺酰氯體積的增加而增強，當加入量大于100 μL時目標化合物的響應強度無明顯變化，本實驗選擇加入100 μL 1 g/L的丹磺酰氯為衍生劑。

2.2 流動相的選擇

目標分析物的良好分離對于檢測方法的建立有著重要作用。參考血漿中有關雌激素的測定方法［25－28］，通過預實驗，優化流動相、流動相比例。考察了乙腈－水和甲醇－水兩組流動相體系對目標化合物的離子化程度及分離效果的影響。結果發現，以甲醇－水體系梯度洗脫時5種酚類化合物的分離效果較好，因此實驗選用甲醇－水作為流動相。正離子檢測模式下，為提高待測物的離子化效率，獲得最佳的分辨率和較高的靈敏度，在流動相中加入0.1%(體積分數)甲酸進行緩沖以增加5種酚類化合物的電離效率和抑制色譜峰拖尾。

2.3 質譜條件的選擇

為了獲得高靈敏度的質譜條件，采用流動注射分析儀將經丹磺酰氯衍生后的1 mg/L的5種酚類化合物及其同位素單標溶液直接注入質譜檢測器，先用全掃描(Scan)模式得到準分子離子，再采用選擇離子(SIM)方式進行采集，以獲得較好的質譜條件。5種酚類化合物的監測離子參數見表1。5種酚類化合物及其同位素的標準提取離子流色譜圖如圖2所示。成人尿液中5種酚類化合物的提取離子流色譜圖如圖3所示。

圖2 5種酚類化合物的標準提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of five EDCs standard

圖3 成人尿液中5種酚類化合物的提取離子流色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of five EDCs in adult urine

2.4 空白基質的選擇

采用含5種酚類化合物濃度極低的尿液作為基質空白。將加入一定量活性炭粉末的尿樣于4℃條件下恒溫攪拌10 h，以充分吸附酚類化合物。3 000 r/min離心分離10 min后，取上清液，過濾膜后得到含極低濃度的5種酚類化合物的空白尿液，4℃條件下保存待用。

2.5 線性關系與檢出限

以甲醇配制濃度分別為0、0.05、0.2、1.0、5.0、25、50、100 μg/L的5種酚類化合物混合標準系列溶液，內標濃度均為5.0 μg/L。以各目標化合物與內標物峰面積的比值(Y)對目標化合物的質量濃度(X)繪制標準曲線，目標物信號強度在0.2～100 μg/L濃度范圍內呈良好的線性關系，相關系數r2值均不低于0.998。以信噪比S/N=3作為儀器的檢出限(LOD)，S/N=10作為儀器的定量下限(LOQ)，結合樣品前處理的稀釋倍數計算得到各化合物的檢出限為0.02～0.27 μg/L，定量下限為0.07～0.87 μg/L。表2為5種酚類化合物的線性方程、相關系數、檢出限及定量下限。

表2 5種酚類化合物的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量下限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients(r2)，LODs and LOQs of five EDCs

2.6 準確度與精密度

為評價本方法的準確度，采用“2.4”含有低濃度目標物的尿液進行回收率實驗，并以多次測定結果的相對標準偏差(RSD)評價方法的精密度。計算回收率結果時扣除樣品的本底值。在空白基質中分別添加低、中、高3個水平的目標分析物，每個加標水平重復測定3次，計算平均加標回收率和相對標準偏差，結果見表3。由表3可見，加標水平為5～50 μg/L時，目標分析物的回收率在85%～125%之間，RSD在0.53%～14.4%之間，表明該方法的準確度和精密度良好。

表3 5種酚類化合物的回收率與精密度(n=3)Table 3 Recoveries and precisions of five EDCs(n=3) /%

2.7 實際樣品分析

將建立的方法應用于40個健康成人志愿者尿液中5種酚類化合物的含量測定。結合樣品前處理的稀釋倍數計算5種酚類化合物的含量，酶解后的測定結果見表4。暴露水平以及相關性分析等后續處理及分析均基于表4所列數據。

表4 40個志愿者尿液中5種酚類化合物的定量結果Table 4 Quantitative results of five EDCs of 40 volunteers ρ/(μg·L－1)

2.7.1 成人尿液中5種酚類化合物的暴露水平 比較了成人尿液中BPA、TCS、E1、E2和EE2之間的差異，酶解后尿液中酚類化合物的暴露水平如表5所示。結果顯示，這5種酚類化合物在所研究人群的尿液中廣泛存在，且個體間不同污染物的暴露劑量存在明顯差異。不同酚類化合物的暴露劑量不同，平均濃度依次為TCS＞E1＞E2＞BPA＞EE2。

表5 成人尿樣中5種酚類化合物暴露水平(n=40)Table 5 The exposure level of five EDCs in adult urine(n=40)

表6 成人尿液中5種酚類化合物的Spearman相關性Table 6 Spearman correlations of five EDCs in adult urine

2.7.2 成人尿液中5種酚類化合物的相關性分析 采用SPSS軟件中Shapiro－wilk s W檢驗對暴露數據進行正態性檢驗分析，數據呈非正態性，經自然對數轉換后仍呈非正態。由于數據呈非正態性，因此采用軟件(SPSS 13.0)中的Spearman非參數相關性分析對5種EDCs的數據進行相關性分析，結果見表6。相關性結果顯示，E1與E2、EE2呈顯著正相關(r=0.80，0.44);E1與BPA和TCS無顯著性差異。研究結果表明，E1與E2、EE23種化合物可能具有共同的暴露源，初步的研究結果需要擴大樣本量進一步驗證。

3 結論

本研究運用液－液萃取的前處理方法，通過優化色譜、質譜條件，建立了用于測定成人尿液中5種酚類化合物的HPLC－ESI MS/MS結合穩定性同位素稀釋的分析方法，并對尿樣中5種酚類化合物的暴露水平進行了評價。實驗結果表明，所研究人群廣泛暴露于這5種酚類化合物，且E1與E2、EE2相關性較高，它們可能具有共同的暴露源。該方法靈敏度高、重現性好、回收率高、操作簡單，適合于尿液中5種酚類化合物的暴露評價分析。

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