高效液相色譜 串聯質譜法同時測定茶葉中290種農藥殘留組分

賈 瑋，黃峻榕，凌 云，馮 峰，鄭月明，儲曉剛

(1．陜西科技大學 生命科學與工程學院，陜西 西安 710021;2．中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123)

茶葉是不可缺少的健康飲品，也是我國的重要出口農產品，歐洲、日本是我國茶葉的重要進口國。茶葉進出口國在制定茶葉標準時需綜合考慮茶葉食品安全和商品進出口兩個方面。歐盟和日本作為農產品進口國，制定的許多農藥最大殘留標準都非常嚴格。國際食品法典委員會(CAC)、歐盟、日本規定茶葉中最高農藥殘留限量(MRL)分別為0.10～50.0、0.01～30.0、0.01～30.0 mg/kg，沒有明確規定殘留限量的均默認為0.01 mg/kg［1］。

茶葉中農藥殘留的常用檢測方法包括酶聯免疫分析法(ELISA)［2］、氣相色譜法(GC)［3－4］、氣相色譜 －質譜法(GC －MS)［5－7］、液相色譜法(HPLC)［8］、液相色譜 － 質譜法(LC － MS)［9－10］、液相色譜 －串聯質譜法(LC－MS/MS)［11－14］等。ELISA、GC和HPLC的方法靈敏度較低，選擇性和特異性較差，不適于多種農殘痕量分析的要求。GC－MS和LC－MS雖然方法靈敏度和特異性較高，但由于難以完全闡明化合物的結構裂解信息，定性準確度方面尚有欠缺，容易產生假陽性結果。而液相色譜－串聯質譜法(LC－MS/MS)因具有靈敏、準確和快速等特點，適用于分析基質復雜、背景干擾嚴重的痕量化合物，同時可在碰撞誘導解離模式下，得到其碎片離子的分子質量，從而進一步對化合物的結構和裂解規律加以確證，定性準確性高。目前，尚未有應用LC－MS/MS法單針進樣同時分析茶葉中200多種農藥的文獻報道。

茶葉與其他植物源性食品相比，富含茶多酚類和色素類化合物，經不同工藝加工的茶葉產品成分也有很大差異。在農藥殘留測定時，不同的成分造成的干擾也會有所不同。因而其農殘檢測凈化方式多采用傳統方法，但這些前處理技術過程復雜，步驟繁瑣，試劑用量大，檢測成本高，干擾較大且不能滿足大批量樣品多組分快速測定要求。且針對四類茶葉樣品，同時采用3個版本的QuEChERS前處理技術(2003 Oringinal，AOAC 2007.12008 CEN 15662)進行比較并優化尚未見報道［15－17］。

本研究采用高效液相色譜－串聯質譜聯用技術，針對四類茶葉樣品，同時對3個版本的QuECh-ERS前處理技術進行比較，并優化了色譜質譜條件，以改進的QuEChERS方法為前處理手段，建立了茶葉中290種農藥殘留的定性確證和定量測定方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Ultra高效液相色譜－串聯四極桿質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);高速組織搗碎機(美的);Avnti J－26×PI型高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司);Vortex.Genie2T旋渦混合器(美國Scientific Industries);振蕩器(日本Yamata SA31);超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司);微孔濾膜(0.20 μm，美國Pall公司);真空氮氣吹干儀(美國Caliper公司)。

甲醇、乙腈(HPLC級，美國Thermo Fisher Scientific公司);C18吸附劑、N-丙基乙二胺吸附劑(PSA，粒徑范圍40～60 μm，平均孔徑100 ，美國安捷倫科技有限公司);石墨化炭黑(GCB，粒徑范圍40～120 μm，美國Supelco公司);無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、氯化鈉、無水醋酸鈉(優級純，上海國藥集團)，500℃灼燒4 h，置于干燥器中備用;倍半水合檸檬酸二鈉、二水合檸檬酸鈉(優級純，美國Sigma公司);乙酸、甲酸、甲酸銨、甲苯(色譜純，美國Sigma公司)。實驗用水均為高純水(經Milli-Q超純水器純化)。

290種農藥標準品均購于Dr.Ehrenstorfer公司。

標準溶液的配制:分別準確稱適量的農藥標準品，用甲醇制成1 000.0 mg/L單一標準儲備液，于－24℃冰箱中保存，根據需要用甲醇水混合溶液(1∶1)稀釋配制成相應濃度的混合標準工作溶液。

基質匹配標準溶液:移取10份各5 mL的空白樣品提取液于15 mL樣品瓶中，以真空氮氣吹干儀吹至近干，分別加入1 000 μg/L的農藥混合標準溶液10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、4 000、5 000 μL于樣品瓶中，各補加甲醇至5 mL，再加5 mL 8 mmol/L甲酸銨水溶液，配制成1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200、400、500 μg/L相應的基質匹配標準溶液。基質匹配標準工作溶液現用現配。

1.2 色譜質譜條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Accucore aQ柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)、Accucore C18預柱(10 mm×2.1 mm，2.6 μm)均為美國Thermo Fisher Scientific公司產品。柱溫:35℃;流動相A為0.1%甲酸－4 mmol/L甲酸銨水溶液，流動相B為0.1%甲酸－4 mmol/L甲酸銨甲醇溶液。梯度洗脫程序:0～1 min，100%A;1～35 min，100% ～0%A;35～40 min，0%A;40～40.1 min，0% ～100%A;40.1～45 min，100%A;流速為300 μL/min;碰撞氣:高純氬氣(純度≥99.999%)，碰撞氣壓力:0.2 Pa;進樣量:10 μL。

1.2.2 質譜條件 電噴霧離子化，正負離子模式自動切換，鞘氣壓力:275 kPa，輔助氣流速3 L/min，毛細管電壓:正離子模式3 000 V，負離子模式2 500 V，Tube lens補償電壓:152 V，Skimmer電壓:20 V。毛細管溫度350℃，霧化溫度(輔助氣):295℃，掃描速度:0.2 s，掃描方式:動態多反應監測(EZ MRM)。質譜分析參數見表1。

1.3 樣品前處理方法

分別取試樣于食品搗碎機粉碎，過0.3 mm篩，混勻。稱取粉碎混勻試樣各10 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入20 mL水浸泡30 min，加入20 mL 1%乙酸－乙腈混合溶液、2.0 g氯化鈉渦旋混合30 s后加入6.0 g無水硫酸鎂、1.5 g無水醋酸鈉，渦旋30 s，振蕩提取5 min，以10 000 r/min離心5 min，取上層溶液10 mL于預先加有75 mg GCB、400 mg PSA及1.2 g無水硫酸鎂的離心管中，高速渦旋30 s，加入0.7 mL甲苯，高速渦旋30 s，以10 000 r/min離心5 min，上層溶液經0.20 μm有機系微孔膜過濾，取200 μL濾液至進樣瓶中，加入300 μL乙腈及500 μL 8 mmol/L甲酸銨溶液。供高效液相色譜－串聯四極桿質譜聯用儀測定。

2 結果與討論

2.1 農藥品種的篩選

根據世界各國和我國茶葉中農藥的最高殘留限量標準［1］，本研究組對400種農藥殘留的檢測條件進行了優化，在實驗中發現:沒有找到母離子(如雙甲脒、DMSA)、子離子(如百草枯、四氟菊酯)和儀器響應過低(如 唑脒、拿草特)的農藥有90多種，加標回收率小于70%或大于130%的農藥(如 唑隆、除喹禾靈)有10種。最終確定對290種農藥殘留進行測定。

2.2 質譜條件的確定

用儀器自帶的針泵以流動注射方式將樣品通過三通與流動相混合后，分別在電噴霧離子源正離子電離(ESI+)模式和負離子電離(ESI－)模式下對290種農藥的單一標準溶液進行母離子全掃描，選擇母離子響應較高的模式，再對其子離子全掃描，每個化合物選擇2對響應值較高的特征離子對作為定量及定性離子對進行MRM參數優化，優化的質譜參數見表1。其中雙特松與敵敵畏，二丙烯草胺與咯喹酮，氯苯胺、靈敵草、凈辛噻酮、西草凈及辛噻酮等相對分子質量相同，保留時間一致，相互間易產生干擾，所以這些化合物需再加入1對定性離子對予以區別。

圖1 不同流動相體系下6種農藥的色譜峰響應值Fig.1 Chromatographic response of 6 pesticides in different mobile phases

2.3 色譜條件的優化

2.3.1 色譜柱的選擇 色譜柱采用Thermo Scientific Accucore 2.6 μm填料，在加快分析速度、提高色譜柱分離度的同時，還能增加峰容量，改善復雜基質中化合物的分離，同時消除了使用小顆粒填料所造成的高反壓問題。本文考察了Accucore系列中RP－MS、C18和aQ 3種不同選擇性的 HPLC色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)對上述290種農藥的分離效果。結果表明采用Accucore aQ色譜柱可獲得最理想的分離效果。

2.3.2 流動相的優化 由于電噴霧質譜的電離是在溶液狀態，因此流動相的組成和添加劑除了影響分析物的保留時間和峰形外，還會影響到分析物的離子化效率，從而影響到目標化合物的檢測靈敏度。本實驗分別以甲醇－水、乙腈－水作為流動相考察290種農藥的分離度、峰形及響應值，以對硫磷(Parathion)、殺螟松(Fenitrothion)、樂果(Dimethoate)、八甲磷(Schradan)、二氧威(Dioxacarb)和苯噻草胺(Mefenacet)為例，發現以甲醇－水為流動相的離子化效率明顯好于乙腈－水流動相。實驗發現加入甲酸和甲酸銨可提高目標化合物的響應值(見圖1)，而加入乙酸銨響應值降低，因此確定以0.1%甲酸－4 mmol/L甲酸銨水溶液和0.1%甲酸－4 mmol/L甲酸銨甲醇溶液為流動相。圖2為按“1.3”方法進行前處理后烏龍茶混合標準溶液的總離子流色譜圖。

圖2 290種農藥的烏龍茶標準溶液(20 μg/L)的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatograms of 290 pesticides standard at 20 μg/L prepared in oolong tea

2.4 樣品前處理條件的優化

2.4.1 提取條件的優化 茶葉為干性樣品，加入乙腈提取前用水浸泡30 min，可以增加溶劑的提取效率。加入氯化鈉使得水與乙腈分層，渦旋后再加入無水硫酸鎂，其中氯化鈉需先于無水硫酸鎂加入溶液，避免同時加入后無水硫酸鈉遇水直接結塊，從而將目標化合物包裹，影響農藥的提取率。無水硫酸鎂用于吸取鹽析分配后有機層中多余的水分。為研究無水硫酸鎂及無水硫酸鈉的使用對于農藥提取效果的影響，按照“1.3”的前處理方式分別加入6.0 g無水硫酸鎂與6.0 g無水硫酸鈉，農藥添加水平為10 μg/L，以苯噻草胺(Mefenacet)、滅線磷(Ethoprophos)、咪唑菌酮(Fenamidone)、芐草隆(Cumyluron)、殺草凈(Dipropetryn)和嘧菌酯(Azoxystrobin)6種農藥的回收率為考察對象。其中苯噻草胺是除草劑中的噻唑多環化合物，滅線磷是有機磷類殺蟲劑，咪唑菌酮為含苯胺基的殺菌劑，芐草隆為含苯甲基除草劑，殺草凈為三嗪類芽前除草劑，嘧菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，這些化合物能代表大多數化合物的結構特點。結果發現使用無水硫酸鎂的回收率優于無水硫酸鈉(見圖3)，原因為在凈化步驟中采用的PSA屬于正相吸附劑，含水量越少凈化效果越好，無水硫酸鎂的吸水能力更佳，且其粒度更小，在振搖與渦旋的過程中可使樣品更加粉碎，并通過與乙腈發生協同作用，提高提取效率［18］。

圖3 2種QuEChERS樣品前處理方法對10 μg/L加標烏龍茶樣品的回收率比較(n=7)Fig.3 Comparison of recoveries of two versions of QuEChERS sample preparation method for oolong tea samples spiked with 10 μg/L pesticides(n=7)

圖4 3種QuEChERS樣品前處理方法對10 μg/L加標烏龍茶樣品的回收率比較(n=7)Fig.4 Comparison of recoveries of three versions of QuEChERS sample preparation method for oolong tea samples spiked with 10 μg/L pesticides(n=7)

由于涉及的農藥種類較多，為了保證酸堿不穩定的農藥不分解，需要加入緩沖鹽體系來保持基質環境的pH值。因此，考察了緩沖鹽的使用對于農藥提取效果的影響，根據2003 Oringinal、國際官方方法AOAC 2007.01與歐洲標準化委員會的標準方法CEN 151662進行實驗，第一組加入1.5 g乙酸鈉和在乙腈中加入1%乙酸(AOAC 2007.01)，第二組加入0.5 g倍半水合檸檬酸二鈉和1.0 g二水合檸檬酸鈉(CEN 151662)，第三組不加緩沖鹽(Oringinal)。農藥添加水平為10 μg/L，以對硫磷(Parathion)、殺螟松 (Fenitrothion)、樂果(Dimethoate)、八甲磷(Schradan)、二氧威(Dioxacarb)和多菌靈(Carbendazim)6種農藥的回收率為考察對象。結果發現加入乙酸和乙酸鈉后，除多菌靈的回收率變化不大，對硫磷、殺螟松、樂果、八甲磷和二氧威的回收率均有所提高(見圖4)。其原因為采用乙酸和乙酸鈉體系可保證樣品基質環境的pH值為5.0～5.5，這既可以保證堿不穩定的農藥(如對硫磷、殺螟松、樂果)的回收率，也可以保證酸不穩定的農藥(如樂果、八甲磷)的回收率，而多菌靈在酸堿溶液中均具有良好的穩定性，所以其回收率變化不大。第一組與第二組均可保證樣品基質的pH值在整個過程中分別保持在5.0～5.5與4.8，且以上6種農藥的回收率十分接近，但從實驗緩沖能力與成本考慮，最終選擇乙酸與乙酸鈉緩沖鹽體系。

2.4.2 凈化條件的優化 Oringinal、國際官方方法AOAC 2007.01與歐盟標準方法CEN 151662的另一處不同在于前兩者均未提及添加C18與石墨化炭黑(GCB)，而后者可以。C18屬于反相吸附劑，可有效除去基質中的脂肪和脂類等非極性有機物，為研究C18的使用對于農藥提取效果的影響，分別進行添加500 mg C18和不添加C18對比實驗，農藥添加水平為10 μg/L，以苯噻草胺(Mefenacet)、滅線磷(Ethoprophos)、咪唑菌酮(Fenamidone)、芐草隆(Cumyluron)、殺草凈(Dipropetryn)和嘧菌酯(Azoxystrobin)6種農藥的回收率為考察對象。結果發現兩組農藥的回收率相近(見圖5)，其原因為茶葉中的脂類等非極性有機物含量較低，而且在提取溶劑中溶解較少。所以針對茶葉樣品，本實驗不加入C18。

圖5 2種QuEChERS樣品前處理方法對10 μg/L加標烏龍茶樣品的回收率比較(n=7)Fig.5 Comparison of recoveries of two versions of QuEChERS sample preparation method for oolong tea samples spiked with 10 μg/L pesticides(n=7)

歐盟標準方法CEN 151662規定，在深色樣品中可加入少量石墨化炭黑(GCB)除色，茶葉樣品經溶劑提取后(不加入GCB)，由于其提取液中存在葉綠素、胡蘿卜素、葉黃素與花青素，且PSA只能除去少量色素，提取液呈墨綠色(綠茶)、棕紅色(烏龍茶、紅茶)、棕黑色(普洱茶)。為了確定GCB用量，分別在10 mL各種茶葉提取液中添加40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 mg GCB，高速渦旋30 s，以10 000 r/min離心5 min，觀察提取液顏色。實驗發現，當加入75 mg GCB時，提取液為黃色透明(烏龍茶、紅茶、普洱茶)或無色透明(綠茶)。但GCB外層為6個碳原子構成的平面六角形，對于片狀化合物有強烈的吸附作用，隨著GCB的加入會導致片狀農藥(如滅線磷 (Ethoprophos)、氧環唑(Azaconazole)、腈苯唑(Fenbuconazole)、吡螨胺(Tebufenpyrad)、克百威(Carbofuran)、嘧霉胺(Pyrimethanil)的回收率降低，通過在提取液中加入甲苯可以洗脫被GCB吸附的農藥，提高該類農藥的回收率。為了確定甲苯的加入量，實驗中加入75 mg GCB，農藥添加水平為10 μg/L，以上述6種農藥的回收率為考察對象，結果見圖6，發現加入0.7 mL甲苯可將被GCB吸附的農藥洗脫;但會對原來未加入甲苯時回收率好的農藥，例如敵敵畏(Dichlorvos)、非草隆(Fenuron)造成影響，原因為溶液中基質雜質增加。綜合上述結果，實驗條件確定為取上層溶液10 mL于預先加有75 mg GCB、400 mg PSA及1.2 g無水硫酸鎂的離心管中，高速渦旋30 s，再加入0.7 mL甲苯。

圖6 甲苯加入量對部分農藥回收率的影響Fig.6 Influence of toluene volume used in purification on recoveries of 8 pesticides

根據2003 Oringinal、國際官方方法AOAC 2007.01與歐盟標準方法CEN 151662中各種提取劑與凈化劑的用量，本實驗在整個過程中對PSA、無水硫酸鎂、氯化鈉與緩沖鹽的用量進行了優化，過程與上述方法相似，形成了適合于茶葉樣品的QuEChERS前處理方式(見“1.3”)。

2.4.3 基質效應 目標化合物的電離容易受到基質的干擾，導致離子抑制或增強，基質匹配標準溶液的響應值比純溶劑的高(見圖2)，且這種影響在各待測物之間存在差異，表明不同農藥受到基質的影響不同。當基質效應影響過大時，會降低方法的靈敏度，影響方法的準確性，因此需要對基質效應進行評價。評價方法為:基質效應=(1－基質匹配標準曲線的斜率/純溶劑標準曲線的斜率)×100%［19］。結果表明在290種農藥中普遍存在基質效應，其中19.2%屬于中等強度的基質效應，2.5%屬于強基質效應，79.3%為較弱基質效應。為最大限度消除基質效應干擾，本實驗采用基質匹配法進行定量分析。以空白茶葉樣品的提取液為標準溶液的稀釋溶液，可使標準溶液和樣品溶液具有相同的離子化環境，從而消除基質效應。

由于測定的化合物較多，本實驗對化合物保留時間的穩定性進行了研究，分別對質量濃度為20 μg/L的混合標準溶液連續測定7次，同樣方法配制標準溶液的化合物出峰時間穩定，漂移時間均小于1.2 s;基質匹配的標準溶液較純標準溶液出峰晚1～9 s，這與María等［20］的測定結果相同，其原因為基質進入色譜后影響了色譜柱的柱效。

2.5 方法學考察

2.5.1 標準曲線與定量下限 配制290種農藥質量濃度依次為1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200 μg/L的系列混合標準溶液。以目標組分的峰面積(y)對相應的質量濃度(x，μg/L)繪制標準曲線。結果發現，其相關系數(r2)均大于0.99，各種農藥質量濃度在1.0～200 μg/L范圍內具有較好的線性關系。用本方法對綠茶、紅茶、烏龍茶、普洱茶樣品進行加標回收實驗，以信噪比(S/N)≥10確定290種農藥的定量下限均可達到0.01 mg/kg。

2.5.2 精密度與加標回收率 對比CAC、歐盟、日本、中國茶葉農殘限量標準規定，歐盟的最高殘留限量(MRL)的規定最為嚴格，本文根據歐盟最高殘留限量(沒有MRL規定的按照日本《食品中農業化學品肯定列表制度》中的“一律標準”與歐盟規定的0.01 mg/kg標準)的1倍、2倍、4倍進行加標回收實驗，結果表明目標分析物的回收率均在61%～119%范圍內，重復實驗7次，其相對標準偏差小于12.4%，加標濃度為MRL(沒有限量規定的按照0.01 mg/kg進行加標)的相對標準偏差和平均回收率測定結果見表1。

表1 290種農藥的保留時間、質譜分析參數、相關系數(r2)、平均回收率與精密度(n=7)Table 1 Retention times，mass spectrometric parameters，correlation coefficients(r2)，recoveries and precisions of 290 pesticides(n=7)

(續表1)

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(續表1)

2.6 實際樣品分析

采用本方法對市售綠茶、烏龍茶、紅茶、普洱茶樣品共10份進行了290種農殘檢測，其中1份檢出啶蟲脒(Acetamiprid)和甲胺磷(Methamidophos)，含量分別為28 μg/kg和37 μg/kg;1份檢出吡蟲啉(Imidacloprid)和噻蟲嗪(Thiamethoxam)，含量分別為12 μg/kg和19 μg/kg;1份檢出乙酰甲胺磷(Acephate)、樂果(Dimethoate)、氧化樂果(Omethoate)、三唑磷(Triazophos)、亞胺硫磷(Phosmet)、三唑酮(Triadimefon)、噻嗪酮(Buprofezin)、水胺硫磷(Isocarbophos)、喹硫磷(Quinalphos)、噠螨靈(Pyridaben)和吡蟲啉(Imidacloprid)，含量分別為 18、26、39、43、29、68、82、29、46、25、14 μg/kg。研究結果表明，本方法可用于茶葉中290種農藥殘留的檢測。

3 結論

本文利用高效液相色譜－串聯質譜聯用技術(HPLC－MS/MS)進行測定，采用QuEChERS方法對樣品進行前處理，建立了茶葉中290種農藥殘留量的測定方法，方法具有良好的靈敏度、準確度和精密度，線性關系良好，能滿足我國、日本和歐盟等國家與組織對于多農殘分析的要求。

致謝:感謝美國Thermo Fisher Scientific公司James Chang和Jia Wang工程師在實驗過程中的幫助和支持。

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