抗KDR單克隆抗體的制備＊

李麗英 譙時文 李東

（樂山職業技術學院人體解剖教研室，四川 樂山614000）

新生血管是指在已存在的血管基礎上，通過發芽或分支方式所形成的新血管。腫瘤的生長和轉移依賴于血管的生成［1］。在血管內皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）家族中，VEGF－A在腫瘤血管新生中發揮著重要作用，它能促使內皮細胞有絲分裂，誘導血管內皮細胞增殖和遷移，促進新生血管形成，還能增加血管通透性［2］。VEGF－A的這些生物學效應主要是通過其血管內皮細胞生長因子受體，又含激酶插入區的受體（Human kinase insert domain containing receptor，KDR）來實現的。KDR是1992年 Terman［3］等最早從人臍靜脈內皮細胞cDNA文庫中，應用與已知受體酪氨酸激酶的同源產物擴增獲得。研究證明，靶向敲除KDR基因，將導致血島形成損傷，并缺乏成熟的內皮細胞，從而使小鼠胚胎于第8.5～9.5d死亡［4］。在成年小鼠中，即使是通過藥物短期阻斷VEGF－A與KDR之間的相互作用，仍然會引起血管退化［5］。鑒于KDR在VEGF－A／KDR信號通路中的重要作用，我們采用雜交瘤技術制備能穩定分泌抗KDR單克隆抗體（Monoclonal Antibody，mAb）的雜交瘤細胞，以期獲得能抑制VEGFA生物學效應的抗KDR mAb。

1 材料與方法

1.1 材料

8～10周齡、18～20g雌性清潔級BALB／c小鼠6只，購自四川大學實驗動物中心，合格證號：SYXK（川）2009－045。小鼠骨髓瘤細胞SP2／0－Ag14、谷胱甘肽轉硫酶蛋白（Glutathione S－transferases，GST）、GST－KDR融合蛋白，由四川大學免疫學教研室提供。次黃嘌呤H、氨基喋呤A、胸腺嘧啶T、聚乙二醇等購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 雜交瘤細胞株的建立

用純化的GST－KDR蛋白作為免疫原，常規皮下免疫BALB／c小鼠2只，50μg·只－1，共4次；末次加強免疫后3d，取小鼠脾臟通過機械分離法制成脾細胞懸液，與小鼠骨髓瘤細胞SP2／0－Ag14在聚乙二醇介導下融合，采用雜交瘤技術建立分泌抗KDR mAb的雜交瘤細胞株。

1.2.2 最佳抗原包被濃度的確定及抗KDR mAb的檢測

按照間接酶聯免疫法（Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）進行，以GST－KDR融合蛋白進行包板，該蛋白濃度為1.6mg·mL－1。先用碳酸鹽緩沖液對GST－KDR融合蛋白進行10倍稀釋，再2倍倍比稀釋，即分別為1、1／2、1／4、1／8、1／16、1／32、1／64、1／128、1／256。再通過間接 ELISA 法檢測雜交瘤細胞的培養上清液。

1.2.3 抗KDR mAb的大量制備及純化

取雌性BALB／c小鼠4只，每只BALB／c小鼠腹腔內注射0.5mL液體石蠟，7d后將建株的雜交瘤細胞（5×106細胞·只－1）接種于小鼠腹腔。10～14d后收集腹水，按飽和硫酸銨法進行鹽析，G－Sephrose 4B親和層析純化，用紫外分光光度計測定其蛋白濃度。

1.2.4 抗KDR mAb效價的測定

采用間接ELISA法測定純化后抗KDR mAb的效價。以（測定孔A450值／陰性對照孔A450值）≥2.1為陽性，選擇陽性孔中的最高稀釋度即為抗KDR mAb的效價。

2 結果

2.1 雜交瘤細胞株的建立

融合細胞接種于4塊96孔細胞培養板，融合后7～10d，觀察到雜交瘤細胞生長孔352孔，細胞融合率為91.7%；初選特異性陽性克隆細胞33孔，陽性率為8.7%。4～5d后，取單克隆培養孔上清液，利用間接ELISA法進行檢測，最終獲得4株只針對 KDR的雜交瘤細胞株，分別是1E8、1F1、2B8、3E9。經有限稀釋法，對陽性克隆孔2B8、3E9進行反復亞克隆，最終獲得1株能穩定分泌抗KDR mAb的雜交瘤細胞株，命名為3E9 B2G11。

2.2 包被抗原最佳濃度的確定

通過間接ELISA法測得GST－KDR包被抗原濃度在2倍倍比濃度稀釋下對應的A450值，以GST－KDR包被抗原濃度為橫坐標，對應的吸光度A450值為縱坐標，通過Excel軟件繪制出圖1，曲線接近水平狀態時的抗原最高稀釋濃度為抗原的最佳包被濃度。由圖1可看出GST－KDR抗原的最佳包被濃度是10μg· mL－1（見圖1）。

2.3 抗KDR mAb的蛋白濃度測定

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）作為標準蛋白質，用雙蒸水倍比稀釋，752型紫外分光光度儀測定A280值，繪制吸光度值－標準蛋白BSA系列濃度梯度曲線（見圖2）。將濃縮純化腹水樣品稀釋10倍進行測定，其A280值為0.42，對應標準曲線，通過Excel軟件FORECAST線性回歸統計分析計算出抗KDR mAb的蛋白濃度為6.1mg·mL－1。

2.4 抗KDR mAb的效價測定

由間接ELISA法測定雜交瘤細胞株3E9B2G11所分泌的抗體效價為1∶16384。

圖1 吸光度－ （GST－KDR）包被抗原濃度梯度曲線

圖2 吸光度值－標準蛋白BSA系列濃度梯度曲線

3 討論

早在1971年，Folkman［6］就提出腫瘤的生長和轉移離不開血管生成，無論何種抗腫瘤新生血管形成的技術都將是對現有腫瘤治療學的強有力的補充。抗血管生成治療腫瘤的策略是：通過阻斷腫瘤組織中血管生長因子對血管內皮細胞的作用來阻止新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長和轉移。目前有許多觀點趨向于采用KDR作為阻斷腫瘤血管新生治療的最佳靶點，理由如下［7］：1）KDR主要表達于活化的內皮細胞，如腫瘤位點；2）由于腫瘤內皮細胞與血液直接接觸，使KDR受體抑制劑更容易達到靶細胞；3）VEGF家族中，除VEGF－A外，其它成員如VEGF－C、－D、－E也可作為KDR的配體；因此，采用KDR受體抑制劑可潛在阻斷它們的刺激作用。Michael［8］等對49例婦科惡性腫瘤患者、61例婦科良性腫瘤患者及12例對照組的血清進行分析發現，在乳腺癌、子宮內膜癌及卵巢癌等惡性腫瘤中，VEGF－A及磷酸化KDR的表達水平都顯著高于良性腫瘤及對照組。KDR高表達于被激活的血管內皮細胞上，若能抑制其活性，阻斷VEGF－A／KDR信號轉導通路，VEGF－A就不能發揮作用，從而達到抗腫瘤新生血管形成的目的。

為了能最大限度地封閉VEGF－A與內源性KDR受體結合，我們以GST－KDR蛋白免疫小鼠，通過雜交瘤技術制備能穩定分泌抗KDR mAb的雜交瘤細胞。本實驗中，我們對GST抗原和GST－KDR抗原都進行包被，取單克隆細胞的上清液同時進行檢測，觀察上清液與GST抗原、GST－KDR抗原的結合情況。通過間接ELISA法對雜交瘤細胞進行篩選，每次只選擇與GST－KDR蛋白反應呈陽性的克隆細胞進行亞克隆，分離出針對KDR單一抗原決定簇的B細胞克隆。經間接ELISA法檢測出只分泌抗GST－KDR蛋白抗體的細胞克隆后，利用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行克隆化。經過3次反復間接ELISA法檢測特異性抗體及反復亞克隆，得到了一株基因型穩定并能穩定分泌抗KDR mAb的雜交瘤細胞株，命名為3E9B2G11。實驗結果證明，用GST－KDR蛋白免疫BALB／C小鼠，可獲得特異、穩定分泌抗KDR mAb的雜交瘤細胞株。這為以后將該抗體改造成小分子酪氨酸激酶抑制劑，使其能進入細胞內與受體KDR特異性結合并阻斷血管內皮細胞生長因子的強大生物學功能奠定了重要的基礎。

1 Kumar R，Fidler IJ.Angiogenic molecules and cancer metastasis［J］.In Vivo，1998，12（1）：27－34.

2 Jin HC，Nitin KG，Elisa L，et al.Corneal Neovascularization：An Anti－VEGF Therapy［J］.Surv Ophthalmol，2012，57（5）：415－429.

3 Terman B，Khandke L，Dougher VM，et al.VEGF receptor subtypes KDR and Flt－1show different sensitivities to heparin and placenta growth factor［J］.Gowth Factor，1994，11（3）：187－195.

4 Shalaby F，Gertsenstein M，Rossant J，et al.Failure of blood－island formation and vasculogenesis in Fik－l deficient mice［J］.Nature，1995，376（6）：62－66.

5 Kamba T.VEGF－dependent plasticity of fenestrated capillaries in the normal adult microvasculature［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290（2）：H560－H576.

6 Folkman J.Tumor angiogenesis：Theraputic implication［J］.N Engl J Med，197l，285（21）：1182－1186.

7 Miao H，Hu K，Jimenea X，et al.Potent neutralization of VEGF biological activities with a fully human antibosy Fab fragment directed against VEGF receptor 2［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，345（1）：438－445.

8 Michael I，Koukourakis，Vassilios L，et al.Serum VEGF levels and tissue activation of VEGFR2／KDR receptors in patients with breast and gynecologic cancer［J］.Cytokine，2011，53（3）：370－375.