弱后酸化保加利亞乳桿菌突變株與親本菌株H+－ATPase基因的相似性比較

劉 飛，焦月華，郭文奎，于 微，谷春濤，霍貴成，*

(1.東北農業大學，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030;2.黑龍江省中醫藥大學，藥物安全性評價中心，黑龍江哈爾濱 150040)

酸奶作為一種具有益生作用的乳制品，已經普遍被消費者認可。但是由于酸奶正常發酵結束后，在產品貯存、運輸、銷售這一過程會發生后酸化，出現消費者不可接受的過酸味及感官品質下降，影響酸奶的保質期［1］。德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)能夠在酸奶產品中繼續生長，并發酵乳糖產酸導致酸奶發生后酸化，它具有較強的耐酸性，當外界環境中pH降低時，其質膜 H+－ATPase(F1F0－ATPase)能通過水解ATP提供的能量將細胞內的質子泵出胞外，形成跨膜的pH梯度差，使細胞內pH維持在近中性，代謝酶的活力不受影響［2］。直至環境中pH3.5時，跨膜pH梯度差才不存在，細胞內呈酸性，新陳代謝活動開始受到抑制［3－4］。然而，理想酸奶產品的 pH4.2 左右。F1F0－ATPase，是由F0和F1亞基組成，其中嵌入細胞膜中的F0亞基是一個通道蛋白，具有質子轉運活性，而當結合在細胞膜內表面的F1亞基被從膜中釋放出來后就具有 ATPase 活性［5－6］。許多研究者發現，乳酸菌的H+－ATPase能夠在其自身細胞內pH的調控過程中發揮主要作用，是乳酸菌維持其細胞內環境pH穩定必不可少的因素。Kobayashi等首先發現了一株糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的突變體失去了調控其自身胞內環境pH的能力，隨后他對這株突變菌株進行了一系列的研究，結果發現導致突變菌株產生這種表型的原因是由于其胞內的H+－ATPase的活性較低［7］。Nannen 和 Hutkins［8］分別對一株嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳亞種、干酪乳桿菌的H+－ATPase進行了研究，結果也表明H+－ATPase能夠調控細胞內的pH，但是他們沒有在分子水平對H+－ATPase的調控機制進行深入的研究。Kullen 和 Klaenhammer［9］還 鑒 定 了 嗜 酸 乳 桿 菌(Lactobacillus acidophilus)中受pH誘導的F1F0－ATPase的操縱子，RT－PCR結果顯示嗜酸乳桿菌在低pH環境中生長時，不但atp基因的轉錄產物會增加，而且細胞膜中 F1F0－ATPase活性也會增加。Amachi等［10］的 Northern 和 Western blot分析結果卻表明，Lactococcus lactis subsp.lactis C2和由它誘變得到的H+－ATPase缺陷的突變菌株 No.1016－51的ATPase的mRNA的豐度沒有明顯差異，他們推測這可能是因為突變菌株也具有一個正常調控ATPase基因表達的系統，但是由于編碼ATPase的結構基因的缺陷導致了突變菌株表達的ATPase的特異活性比親本的低，遺憾的是他們并沒有通過測序來驗證親本和突變菌株H+－ATPase編碼基因是否的確發生了突變。Ongol等［11］的研究也表明 H+－ATPase缺陷的突變株德氏乳桿菌保加利亞亞種SBT0164 No.55－1的H+－ATPase活性的降低是導致其不能夠在pH為4.5的MRS培養基中繼續生長的原因，但是他們并沒有利用分子生物學技術在基因水平或者轉錄水平對突變菌株的 H+－ATPase進行分析。因此，H+－ATPase缺陷的突變株對H+－ATPase活性的調控到底是由于編碼基因的突變引起的，還是菌體細胞在轉錄水平或者翻譯時進行調控還有待進一步的研究。針對這一問題，在本研究中，以通過誘變育種得到的具有弱后酸化能力的H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株 KLDS 1.9201－11和親本菌株KLDS 1.9201 為研究對象［12］，分別擴增它們 H+－ATPase的編碼基因，并用DNAMAN軟件比較它們之間的相似性，為闡明乳酸菌H+－ATPase的調控機制提供理論依據，并為最終開發弱后酸化的酸奶發酵劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)KLDS 1.9201和KLDS 1.9201－11 東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室菌種庫(DICC)保藏菌種;rTaq酶、dNTP、Pfu、RNase A、DNA Marker DL2000 寶生物工程有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒和溶菌酶 天根生化科技有限公司。

臺式高速離心機AnkeTGL－16C 上海安亭科學儀器廠;凝膠成像UVP 美國Thermo公司;紫外分光光度計DU－800 Beckman Coulter公司;電泳儀DYY－10C型 北京六一儀器廠;Gene Amp PCR System 9700 美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 應用天根公司的基因組提取試劑盒提取細菌基因組DNA，所提取的基因組DNA為后續PCR擴增實驗所用，按照試劑盒說明書操作。

1.2.2 基因組DNA的電泳鑒定 取3μL收集的基因組DNA溶液，用質量分數為1.5%的瓊脂糖進行凝膠電泳，經EB染色，紫外燈下觀察基因組條帶的純度和完整性。

1.2.3 H+－ATPase編碼基因的 PCR擴增 查找Genebank中的德氏乳桿菌保加利亞亞種的基因組信息，發現德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC 11842的H+－transporting ATPase/ATP synthase共有8個亞基，分別為 A、B、C、alpha、beta、gamma、epsilon 和 delta，對應的編碼基因分別為 atpB、atpF、atpE、atpA、atpD、atpG、atpC、atpH。由于其中 atpB 和 atpE、atpF 和atpH基因在基因組上相鄰。因此分別利用6個PCR反應擴增H+－ATPase基因的全序列和H+－ATPase基因的調控序列，使用Primer Premier 5.0設計擴增引物，使用oligo 6.0對引物進行評估，然后由上海生工合成。PCR反應體系如下:滅菌ddH2O，37μL;10×Buffer，5μL;dNTP，4μL;基因組 DNA，1μL;上游引物，1μL;下游引物，1μL;Pfu(1U/μL)，1μL。PCR 反應條件如下:94℃ 5min;94℃ 1min，55℃ 1min，72℃2min，共30個循環;72℃ 10min;之后4℃恒溫。PCR反應中所用的引物見表1。

1.2.4 PCR產物的電泳鑒定 PCR擴增結束后，取5μL擴增產物，用質量分數為1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳，經EB染色，紫外燈下觀察擴增條帶。

1.2.5 PCR產物的測序 PCR產物送交上海生工生物工程技術服務有限公司純化后測序。

1.2.6 H+－ATPase編碼基因的相似性比較 利用DNAMAN軟件比較親本和突變菌株的H+－ATPase各亞基編碼基因和調控基因的相似性。

2 結果與討論

2.1 基因組的電泳結果

采用天根公司的細菌基因組DNA提取試劑盒提取 KLDS 1.9201和 KLDS 1.9201－11的基因組DNA，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。

由圖1可知，利用試劑盒提取的KLDS 1.9201和KLDS 1.9201－11的基因組DNA的純度很高，紫外分光光度計測定結果表明OD260/OD280=1.81、OD260/OD230=2.28，因此可知提取的基因組DNA沒有RNA、蛋白和鹽類物質的污染，可以直接用于PCR擴增H+－ATPase

表1 PCR反應引物Table1 Primers of PCR

圖1 KLDS1.9201和KLDS1.9201－11的基因組Fig.1 Genome of KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

2.2 H+－ATPase編碼基因的擴增結果

以達到純度和濃度標準的KLDS 1.9201和KLDS 1.9201－11基因組DNA為模板，特異引物擴增atpA、atpD、atpG、atpC、atpB 和 atpE、atpF 和 atpH 基因，擴增結果如下。

由圖2可知，第1和泳道分別為KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中atpB和atpE基因的PCR產物，條帶清晰，且無非特異性條帶出現。

圖2 KLDS1.9201和 KLDS1.9201－11atpB和atpE基因的PCR產物Fig.2 PCR product of atpB and atpE in KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

由圖3可知，第1和2泳道分別為KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中 atpF和 atpH基因的PCR產物，條帶清晰，且無非特異性條帶出現。

圖3 KLDS1.9201和 KLDS1.9201－11 atpF和atpH基因的PCR產物Fig.3 PCR product of atpF and atpH in KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

由圖4可知，第1和2泳道分別為KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中atpA基因的PCR產物，條帶清晰，而且無非特異性條帶出現。

圖4 KLDS1.9201和KLDS1.9201－11atpA基因的PCR產物Fig.4 PCR product of atpA in KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

由圖5可知，第1和2泳道分別為KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中atpG基因的PCR產物，條帶清晰，而且無非特異性條帶出現。

由圖6可知，第1和2泳道分別為KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中atpD基因的PCR產物，條帶清晰，而且無非特異性條帶出現。

由圖7可知，第1和2泳道分別為KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中atpC基因的PCR產物，條帶清晰，且無非特異性條帶出現。在本研究中，根據GeneBank中德氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC11842的全基因組序列中，編碼 H+－transporting ATPase/ATP synthase的序列為模板一共設計了6對引物，使用PCR分別擴增了KLDS 1.9201和KLDS 1.9201－11的H+－transporting ATPase/ATP synthase的8個亞基A、B、C、alpha、beta、gamma、epsilon 和 delta 的編碼基因 atpB、atpF、atpE、atpA、atpD、atpG、atpC、atpH 全序列。由于本實驗需要比較親本和突變菌株 H+－transporting ATPase/ATP synthase編碼基因的相似性，因此在PCR擴增的過程中需要使用高保真的Pfu DNA聚合酶，從而將堿基錯配的誤差降低到最小程度。

圖5 KLDS1.9201和 KLDS1.9201－11中atpG基因的PCR產物Fig.5 PCR product of atpG in KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

圖6 KLDS1.9201和 KLDS1.9201－11中atpD基因的PCR產物Fig.6 PCR product of atpD in KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

2.3 親本和突變菌株H+－ATPase編碼基因的相似性比較

圖7 KLDS1.9201和KLDS1.9201－11中atpC基因的PCR產物Fig.7 PCR product of atpC in KLDS1.9201 and KLDS1.9201－11

利用DNAMAN軟件，對 KLDS 1.9201和 KLDS 1.9201－11的H+－ATPase編碼序列之間的相似性進行了比較，結果發現它們 H+－transporting ATPase/ATP synthase的8 個亞基 A、B、C、alpha、beta、gamma、epsilon和 delta的編碼基因 atpB、atpF、atpE、atpA、atpD、atpG、atpC和atpH之間的序列相似性為100%，這說明突變菌株的 H+－transporting ATPase/ATP synthase的編碼序列并沒有發生突變，親本和突變菌株H+－ATPase活力之間的差異并不是由于它們的編碼基因發生了變化，親本和突變菌株的H+－ATPase酶蛋白的結構是相同，而可能是由于H+－ATPase的表達量降低引起的。本研究還比較了KLDS 1.9201和德氏乳桿菌保加利亞亞種 ATCC11842的 H+－transporting ATPase/ATP synthase的編碼基因序列，結果表明atpB、atpA、atpC和atpD的相似性為100%，atpE、atpF分別有1個和2個核苷酸的差異，但是它們編碼的氨基酸沒有發生變化，atpH和atpG分別有1個和2個核苷酸的差異，而且編碼的氨基酸也發生了變化。但是總的來說H+－transporting ATPase/ATP synthase的編碼基因序列還是非常的保守，本實驗中突變菌株的H+－transporting ATPase/ATP synthase的編碼序列并沒有發生突變也進一步說明了此基因序列的高度保守性，因此，H+－ATPase缺陷菌株活力的降低并不是由于結構基因發生了突變，極有可能是由于轉錄水平的降低引起的，需要利用更先進的熒光定量PCR技術來進行進一步的分析，從而闡明H+－ATPase的調控機制。

3 結論

同親本菌株KLDS 1.9201相比，突變菌株KLDS 1.9201－11的 H+－ATPase活性的降低并不是由于H+－ATPase編碼基因發生了突變導致表達的 H+－ATPase蛋白的結構發生了變化，從而導致酶活性的降低，而可能是由于H+－ATPase的表達量降低引起的，需要進行qRT－PCR檢測，因此本研究為進一步確定乳酸菌H+－ATPase的調控機制奠定了基礎。

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