響應(yīng)面法優(yōu)化蘭州百合多糖的提取工藝

高丹丹，安文強(qiáng)，陳 紅

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030)

百合為百合科百合屬植物，是世界著名的藥食兩用的植物，始載于我國(guó)現(xiàn)存最早的藥物學(xué)專(zhuān)著《神農(nóng)本草經(jīng)》，主要研究表明，百合中含有的甘油酯、甙類(lèi)、生物堿及多糖等成分都具有重要的藥用價(jià)值，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，百合具有養(yǎng)陰清肺、清心安神、止咳化痰、美容養(yǎng)顏的功效。百合中含有多種活性多糖，屬于植物性多糖，是由單糖之間脫水形成糖苷鍵［1］，具有非常重要的生理活性，具有明顯的補(bǔ)益作用和增強(qiáng)免疫的作用，同時(shí)具有降血糖、降血脂、抗疲勞、抗衰老等生物學(xué)功能［2］。百合多來(lái)源于栽培，也有少數(shù)為野生百合，蘭州是百合在西北的一個(gè)重要產(chǎn)地，其資源豐富，品質(zhì)優(yōu)越，儼然已成為蘭州的一大標(biāo)志性特產(chǎn)。蘭州百合在食用和藥用兩方面都具有非常大的價(jià)值。隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們已經(jīng)開(kāi)始致力于對(duì)百合保健功能的研究，百合多糖的提取已經(jīng)引起了人們的注意。響應(yīng)面分析法是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件并且能研究幾種因素間交互作用的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，該方法實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精度高［3－5］。目前，有關(guān)蘭州百合多糖的提取工藝報(bào)道大多數(shù)都是利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取因素進(jìn)行優(yōu)化［6－7］，極少有人采用響應(yīng)面分析法提取蘭州百合多糖。本研究在單因素的基礎(chǔ)上利用Box－Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對(duì)蘭州百合多糖提取工藝的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以多糖的得率為響應(yīng)值，獲得最佳的提取工藝條件，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)、利用蘭州百合資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘭州百合干 蘭州市國(guó)芳綜超;葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、無(wú)水乙醚 均為分析純。

電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠(chǎng);TGL－16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;723P分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;N－1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司;A－1000S抽濾機(jī) 上海愛(ài)朗儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘭州百合多糖的提取工藝 將百合干放入微型植物粉碎機(jī)中磨成粉末后，過(guò)70目篩，篩下物放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ?g百合干粉按一定料液比(浸提液用超純水)放入恒溫水浴鍋中浸提，浸提一定時(shí)間后取出，冷卻，裝入離心管中，于4000r/min離心10min，棄去雜質(zhì)，留其上清液，在上清液中加入3倍量的乙醇，置于4℃冰箱中靜置過(guò)夜［7］。抽濾并取沉淀，用一定量的蒸餾水沖洗濾紙，向溶液中加入配制好的Sevag試劑(氯仿/正丁醇體積比為5∶1)除蛋白直至無(wú)絮狀沉淀［8］，棄掉氯仿混合液層，重復(fù)操作3次，收集液體，加入3倍量的乙醇沉淀，再次放入4℃的冰箱中靜置過(guò)夜，抽濾得沉淀，所得沉淀依次用無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚淋洗，收集洗凈的沉淀，于冷凍干燥機(jī)中干燥，即可得粗百合多糖。

1.2.2 百合多糖含量的測(cè)定 采用苯酚－硫酸法測(cè)定蘭州百合多糖的含量［9］。計(jì)算公式如下:

多糖的提取率(%)=多糖的濃度(μg/mL)×溶液體積(mL)×稀釋倍數(shù)/原料質(zhì)量(g)×10－6×100

1.2.3 蘭州百合多糖提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn) 選取提取溫度(40、50、60、70、80℃)、提取時(shí)間(1、2、4、6、8h)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)3 個(gè)參數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化蘭州百合多糖提取工藝 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比作為自變量進(jìn)行三因素三水平的Box－Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，水平分別以－1、0、1編碼，以百合多糖的得率為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Experimental design and variables levels for Box－Behnken

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同提取溫度對(duì)百合多糖提取率的影響 在固定提取時(shí)間為4h、料液比為1∶10的條件下，比較提取溫度分別為40、50、60、70、80℃時(shí)對(duì)百合多糖提取率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，可知從40℃起至60℃之間，百合多糖的提取率隨著溫度的升高而升高，且升高速度較快;在60℃后，百合多糖的提取率趨于平緩，由于考慮到溫度過(guò)高可能使多糖的活性發(fā)生變化，而且百合中的蛋白也易變性［10］，所以將最佳提取溫度定為60℃。

圖1 溫度對(duì)蘭州百合多糖提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on the extraction rate of polysaccharide

2.1.2 不同的提取時(shí)間對(duì)百合多糖提取率的影響 在固定提取溫度為60℃、料液比為1∶10的條件下，比較提取時(shí)間分別為1、2、4、6、8h 時(shí)對(duì)百合多糖提取率的影響。結(jié)果如圖2所示。6h內(nèi)百合多糖的提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大;當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)6h，多糖的提取率略有下降，這是由于大部分多糖都已經(jīng)溶出并達(dá)到平衡，而且多糖逐漸被降解為單糖，所以多糖提取率不再提高而是略微下降［11］。多糖的提取時(shí)間過(guò)低時(shí)，由于細(xì)胞壁的破壞程度不夠，多糖不能夠完全溶出，提取率較低［12］。考慮到節(jié)約資源，選取提取時(shí)間為6h。

圖2 提取時(shí)間對(duì)蘭州百合多糖提取率的影響Fig.2 Effect of time on the extraction rate of polysaccharide

2.1.3 不同的料液比對(duì)百合多糖提取率的影響 固定提取溫度為60℃、提取時(shí)間為6h，比較料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 對(duì)百合多糖提取率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3，百合多糖的提取率隨著料液比的升高而升高，可是在1∶25以后料液比對(duì)百合多糖提取率的影響趨于緩慢，多糖提取率有所下降，這是因?yàn)槿艏铀^(guò)多，則提取液過(guò)多，降低了浸提效率，同時(shí)增大了醇沉?xí)r乙醇的使用量，造成了資源的浪費(fèi)。所以選取1∶25的料液比為最佳料液比。

圖3 料液比對(duì)蘭州百合多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of Lily flour to solution(W/V)on the extraction rate of polysaccharide

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化蘭州百合多糖提取工藝

2.2.1 Box－Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 蘭州百合多糖提取工藝的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)依據(jù)Box－Behnken中心法設(shè)計(jì)了17組實(shí)驗(yàn)，其中包括5組中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示。

利用Design Expert 6.0軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程為:Y=12.09+0.58A+0.26B+0.60C－1.07A2－2.96B2－1.30C2+0.49AB+0.87AC+0.53BC

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Box－Behnken design matrix and the experimental results

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。從模型的方差分析表可知，本實(shí)驗(yàn)所選取的二次多項(xiàng)式模型具有高度的顯著性(p＜0.0001)。失擬項(xiàng)為0.3099＞0.05，故失擬項(xiàng)不顯著。決定系數(shù)0.9855，校正決定系數(shù)為0.9668，此數(shù)值說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢越忉?6.68%響應(yīng)值的變化，只有總變異的3.32%不可以用此模型解釋?zhuān)砻髟撃Ｐ偷臄M合度良好，可以使用此模型對(duì)蘭州百合多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表3 回歸模型方差分析表Table3 Variance analysis for the fitted quadratic Polynomial model

從回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)(表4)可知，A、C、A2、B2、C2、AB、AC和 BC八個(gè)因素對(duì)提取率的影響顯著，表明在百合多糖提取的過(guò)程中，溫度和料液比對(duì)提取率有顯著的影響;AB、AC和BC顯著，說(shuō)明在提取的過(guò)程中，溫度和提取時(shí)間、溫度和料液比以及提取時(shí)間和料液比的交互作用也會(huì)對(duì)多糖提取率造成顯著影響。

2.2.2 響應(yīng)面與等高線(xiàn)分析 圖5～圖7是根據(jù)多元回歸方程所得到的不同因素對(duì)蘭州百合多糖得率影響的響應(yīng)面圖。通過(guò)該組圖可以對(duì)任意兩個(gè)因素及其交互作用進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，并從中確定出最佳的因素水平的范圍。研究表明，等高線(xiàn)的形狀可以反映出交互作用的強(qiáng)弱，越趨向于橢圓表示交互作用越強(qiáng)，越趨向于圓形表示交互作用越弱［13－14］。

圖5表明了提取溫度和提取時(shí)間對(duì)百合多糖得率的交互作用，由圖可知，等高線(xiàn)的形狀呈橢圓，說(shuō)明了提取溫度和提取時(shí)間之間的交互作用顯著。當(dāng)提取溫度不變時(shí)，提取率隨著提取時(shí)間的增大而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);當(dāng)提取時(shí)間不變時(shí)，提取率隨著提取溫度的增大而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，溫度上升到一定值，百合多糖的提取率變化趨于平緩。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table4 Regression coefficients and their significance of the quadratic model

圖5 溫度和時(shí)間交互作用對(duì)百合多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.5 Response surface plot for the effects of variables on extraction rate of polysaccharide versus temperature and time

圖6表明了提取溫度和料液比對(duì)百合多糖得率的交互作用，由圖可知，等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明了提取溫度和料液比之間的交互作用顯著。當(dāng)提取溫度較低時(shí)，百合多糖的提取率隨料液比的增加呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì);當(dāng)提取溫度較高時(shí)，百合多糖的提取率隨著料液比的增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而后多糖提取率的增加趨于平緩。當(dāng)料液比較低時(shí)，百合多糖的提取率隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);當(dāng)料液比較高時(shí)，百合多糖的提取率隨著溫度的升高而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，達(dá)到一定的溫度后，上升的趨勢(shì)趨于平緩。

圖7表明了提取時(shí)間和料液比對(duì)百合多糖得率的交互作用，由圖可知，因?yàn)槠涞雀呔€(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明了提取時(shí)間和料液比的交互作用比較顯著。當(dāng)提取時(shí)間不變時(shí)，百合多糖的提取率隨著料液比的增大而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);當(dāng)料液比不變時(shí)，百合多糖的提取率隨著提取時(shí)間的增加而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì);由響應(yīng)面圖可知，后者增大或減小的趨勢(shì)要比前者略微明顯。

圖6 溫度和料液比交互作用對(duì)百合多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.6 Response surface plot for the effects of variables on extraction rate of polysaccharide versus temperature and Lily flour to solution(W/V)

圖7 時(shí)間和料液比交互作用對(duì)百合多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.7 Response surface plot for the effects of variables on extraction rate of polysaccharide versus time and Lily flour to solution(W/V)

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Box－Behnken實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)結(jié)果和回歸方程，利用Design Expert6.0軟件處理所得數(shù)據(jù)，從中可以獲得一組最佳的蘭州百合多糖的提取條件:溫度為64.7℃、時(shí)間為6.12h、料液比為1∶30，在此條件下得到的蘭州百合多糖的得率為12.37%。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，用實(shí)驗(yàn)得出的最佳條件進(jìn)行蘭州百合多糖提取的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，通過(guò)3組平行實(shí)驗(yàn)得到的百合多糖提取率為12.28%、11.73%、12.05%，平均提取率為12.02%，與理論計(jì)算值的誤差在±1%以?xún)?nèi)，可見(jiàn)該模型可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)際多糖提取率的情況。

3 結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定了提取溫度為60℃、提取時(shí)間為6h、料液比為1∶25。用 Box－Benhnken設(shè)計(jì)三因素三水平的實(shí)驗(yàn)，利用Design－Expert6.0進(jìn)行多元回歸擬合，得到蘭州百合多糖得率和各影響因素的多元二次回歸方程為:Y=12.09+0.58A+0.26B+0.60C－1.07A2－2.96B2－1.30C2+0.49AB+0.87AC+0.53BC。方差分析表明，該模型可以較好的反映出提取溫度、提取時(shí)間、料液比與百合多糖得率的關(guān)系。并對(duì)蘭州百合多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳提取條件為:溫度64.7℃、時(shí)間為6.12h、料液比為1∶30，在此提取條件下，百合多糖的得率可達(dá)到12.37%，而經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得到的實(shí)際值為12.02%，此實(shí)驗(yàn)的理論值與實(shí)際值相差不大。實(shí)驗(yàn)證明，響應(yīng)面分析法可以有效地對(duì)蘭州百合多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，這對(duì)進(jìn)行生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)意義。

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