膀胱癌中MMP-2及TIMP-2的表達與病理分期和預(yù)后的相關(guān)性

張金平，孫發(fā)林，周大海

膀胱癌在泌尿系腫瘤中發(fā)病率最高，其腫瘤的生物學(xué)行為比較復(fù)雜，病變的發(fā)生發(fā)展受多種基因的控制和調(diào)節(jié)。復(fù)發(fā)是導(dǎo)致膀胱癌患者多次接受手術(shù)的主要原因，而轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致膀胱癌患者病死的主要原因。如何界定膀胱癌的惡性程度，早期將具有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移潛能的患者篩選出來，給予密切的隨訪和積極、合理的治療，有重要意義。近年來認為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程的形成受多個基因調(diào)控。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）具有降解細胞外基質(zhì)（EMC）的能力，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）是體內(nèi)天然存在的MMPs抑制劑。本研究采用免疫組化方法對膀胱癌組織和癌旁組織MMP-2和TIMP-2的表達與病理學(xué)分級、分期和預(yù)后情況的相關(guān)性進行分析，了解其是否能對提高膀胱癌惡性程度的認識、預(yù)后的情況預(yù)測具有臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 40份標(biāo)本全部來自青島大學(xué)附屬醫(yī)院和解放軍第 401醫(yī)院泌尿外科 2009￣01—2010￣06行開放手術(shù)治療的膀胱癌患者，另選擇正常膀胱黏膜10例作為對照組。40例中膀胱部分切除術(shù)32例，膀胱全切除術(shù)8例。男28例，女12例；年齡37～76歲，平均60.2歲；第1次發(fā)病25例，復(fù)發(fā)15例。UICC TNM標(biāo)準(zhǔn)病理分期，Tis~T1期22例，T2~T3期18例。WHO分類標(biāo)準(zhǔn)進行病理分級，G1級11例，G2級13例，G3級16例，全部為移行細胞癌。膀胱部分切除術(shù)的患者，手術(shù)切除范圍：包括癌腫及基底部膀胱壁和距離癌緣2 cm的黏膜及膀胱壁[1]；術(shù)中取癌組織和癌旁2 cm組織各1塊；膀胱全切標(biāo)本在離體5 min內(nèi)進行取材。標(biāo)本取材后分別放入10%甲醛液中固定。患者術(shù)后常規(guī)經(jīng)尿道膀胱灌注絲裂霉素。術(shù)后對12例行膀胱部分切除術(shù)患者進行膀胱鏡檢查1次/3個月，以后進行膀胱鏡檢查1次/6個月。對8例行膀胱全切術(shù)患者術(shù)后10個月行盆腔超聲檢查。

1.2 實驗方法 鼠抗人MMP-2單克隆抗體、鼠抗人TIMP-2單克隆抗體、3%H2O2去離子水、EDTA抗原修復(fù)液 （pH9.0）、APES、PBS 緩沖液（pH7.4，0.01 mol/L）、免疫組化試劑及染色試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。載玻片防脫片劑處理：選擇APES，撈片后置烤箱58～60℃ 5 min，以使切片緊密粘附；切片脫蠟；新鮮配制3%雙氧水，室溫5～10 min以滅活內(nèi)源性酶；蒸餾水洗3次；pH9.0 EDTA抗原修復(fù)液行微波抗原修復(fù)。全部標(biāo)本均常規(guī)石蠟包埋、切片及染色。應(yīng)用免疫組化SP法。一抗選用鼠抗人MMP-2、TIMP-2單克隆抗體，MMP-2、TIMP-2、SP試劑購買自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 抗體稀釋度效價分別為 1∶800、1∶500、1∶100，切片常規(guī)脫蠟、水化，pH9.0 EDTA抗原修復(fù)液行微波抗原修復(fù)。用已知胃癌切片作陽性對照，陰性對照一抗用PBS取代。常規(guī)SP技術(shù)操作，DAB染色。顯微鏡觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性的胃癌切片作為陽性對照，按上述步驟操作。

1.3 結(jié)果判定 ①MMP-2和TIMP-2染色陽性信號均呈棕色定位于細胞胞漿內(nèi)；判定方法為在鏡下觀察，根據(jù)棕色反應(yīng)的陽性強度及面積判定結(jié)果；②評分標(biāo)準(zhǔn)[2]：MMP-2：無陽性細胞為（-）；陽性細胞數(shù)≤10%為（+），10%～75%為（++），>75%為（+++）；TIMP-2：0分為陰性，1分為局限性 （<0%的腫瘤細胞或間質(zhì)組織）弱陽性，2分為彌漫性（<10%的腫瘤細胞或間質(zhì)組織）弱陽性或局限性（>10%的腫瘤細胞或間質(zhì)組織）強陽性，3分為彌漫性強陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)輸入計算機，用統(tǒng)計軟件SPSS11.5處理。不同部位、病理分級、臨床分期的蛋白表達的顯著性分析均采用χ2檢驗法，以P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 MMP-2和TIMP-2在正常膀胱黏膜組織及膀胱癌 （BTCC）組織中的表達 10例正常膀胱黏膜MMP-2和 TIMP-2的表達均為陰性，細胞質(zhì)內(nèi)無深棕色顆粒。在BTCC組織中MMP-2及TIMP-2的表達詳見表1；癌旁組織中MMP-2及TIMP-2的表達詳見表2。經(jīng)過χ2檢驗證實BTCC組織中MMP-2和TIMP-2的陽性率顯著高于癌旁組織（P<0.01）。

2.2 BTCC組織中MMP-2和TIMP-2的表達與BTCC病理分級分期的關(guān)系 在BTCC組織中MMP-2和TIMP-2的表達與BTCC病理分級分期的關(guān)系詳見表1。經(jīng)過χ2檢驗證實，MMP-2的陽性表達與臨床分期、分級呈正相關(guān)（P<0.01）；TIMP-2的陽性表達與臨床分期、分級無明顯相關(guān)（P>0.05），見表1。

2.3 癌旁組織中MMP-2和TIMP-2的表達與BTCC病理分級、分期關(guān)系 在癌旁組織中MMP-2和TIMP-2的表達與BTCC病理分級、分期關(guān)系詳見表2。經(jīng)過χ2檢驗證實，MMP-2的陽性表達率與臨床分期、分級呈正相關(guān)（P<0.05）；TIMP-2的陽性表達率與臨床分期、分級相關(guān)性不顯著（P>0.05），見表2。

2.4 MMP-2、TIMP-2的表達與膀胱癌1年內(nèi)及2年內(nèi)復(fù)發(fā)的關(guān)系 40例患者之中有32例行膀胱部分切除術(shù)，對這32例患者術(shù)后常規(guī)膀胱灌注絲裂霉素化療，復(fù)查膀胱鏡1次/3~6個月，結(jié)果12例膀胱癌1年內(nèi)復(fù)發(fā)，其余28例患者2年內(nèi)未復(fù)發(fā)。這12例膀胱癌復(fù)發(fā)患者的BTCC組織和癌旁組織中MMP-2和 TIMP-2的表達率 91.6%（11/12），33.3%（4/12）與 66.7%（8/12），16.7%（2/12）。 經(jīng)過 χ2檢驗證實BTCC組織和癌旁組織中MMP-2的表達率與膀胱癌1年內(nèi)復(fù)發(fā)率呈正相關(guān) （P<0.01）；BTCC組織和癌旁組織中TIMP-2的表達率與膀胱癌1年內(nèi)復(fù)發(fā)率呈負相關(guān)（P<0.05）。

表 1 BTCC組織中MMP-2和TIMP-2的表達與臨床分期的關(guān)系

表 2 癌旁組織中MMP-2和TIMP-2的表達與臨床分期的關(guān)系

3 討 論

3.1 MMP-2和TIMP-2在惡性腫瘤組織中的表達及意義 腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，是一個多步驟、多因素參與的極其復(fù)雜的過程[3]。腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移必須首先脫離原發(fā)灶，黏附在細胞外基質(zhì)上，爾后降解基質(zhì)并通過降解的基質(zhì)進行移動，穿透基底膜進入間質(zhì)或體液循環(huán)而發(fā)揮作用[4]。腫瘤細胞從原發(fā)瘤脫離后，必須穿透原發(fā)瘤周邊的ECM，才能進入血管和淋巴管，ECM是阻止腫瘤細胞移動的生理屏障，其完整與否是影響腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。大量實驗證明，瘤細胞穿透基底膜的這種侵襲能力的獲得與其產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶，降解ECM有關(guān)，其中最重要的一組蛋白酶是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），它幾乎能降解細胞外基質(zhì)和基底膜的所有成分，對腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移起著極為重要的作用[5]。Ⅳ型膠原酶是MMPs家族中主要成員之一，它分為兩個亞型，即MMP-2（72 kD，明膠酶 A）和 MMP-9（92 kD，明膠酶 B）。Ⅳ型膠原是基底膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白，MMP-2是Ⅳ型膠原的降解酶，TIMP-2通過與MMP-2形成復(fù)合物，從而抑制MMP-2的降解活性。BTCC組織通過高表達MMP-2和（或）低表達TIMP-2，降解Ⅳ型膠原，Ⅳ型膠原降解加快，基底膜破壞，有助于膀胱癌細胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移。在癌旁組織中MMP-2呈局灶狀表達，尤其是在癌巢的邊緣或血管的周圍染色特別深，這被認為是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的前期工作。

Liotta等[6]首先報道了MMP-2在癌細胞轉(zhuǎn)移中的作用，Talvens uari-Matlila等[7]采用免疫組化方法測定177例原發(fā)性乳腺癌患者組織樣本，發(fā)現(xiàn)84%MMP-2陽性，且陽性者生存期明顯短于陰性者，在前10年隨訪中，患者病死危險性明顯增加，認為MMP-2陽性為乳腺癌患者低生存率的獨立預(yù)后因素。國內(nèi)對乳腺癌患者組織樣本研究表明，MMP-2總陽性表達率為68%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的30例乳腺癌組織中有24例MMP-2陽性（80%），而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的30例乳腺癌組織中有17例MMP-2陽性（56.7%），臨床分期越晚MMP-2的陽性表達越高，MMP-2可能具有促進乳腺癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的作用；5年隨訪結(jié)果，MMP-2陽性組生存率明顯低于MMP-2陰性組。提示MMP-2可作為乳腺癌不良預(yù)后判定指標(biāo)，且獨立應(yīng)用有意義。

TIMPs是MMPs的特異性抑制劑，目前已知的TIMPs主要有四種：TIMP-1、2、3 和 TIMP-4，TIMP-2對MMP-2活性的抑制特別重要[8]。TIMP-2可與MMP-2 酶原及其活化形式形成 1∶1（mol）穩(wěn)定復(fù)合物，從而抑制MMP-2的產(chǎn)生及其活性，TIMP-2與膠原酶由同一個細胞分泌，因此只有當(dāng)活化的膠原酶量超過TIMP-2時，才有膠原的水解,MMP-TIMP在維持ECM穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。TIMPs除了具有抑制MMPs降解活性，保持基底膜完整，另外還有抑制腫瘤新生血管形成的作用[9,10]。

3.2 MMP-2和TIMP-2的表達失衡是癌腫局部侵犯、遠處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的原因之一 基底膜是阻止腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的天然屏障，Ⅳ型膠原是基底膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白，MMP-2是Ⅳ型膠原的降解酶，TIMP-2通過與MMP-2形成復(fù)合物，從而抑制MMP-2的降解活性。在正常組織中兩者是平衡的，共同參與Ⅳ型膠原的代謝調(diào)節(jié)，維持基底膜的正常結(jié)構(gòu)和生理功能。惡性腫瘤組織通過高表達MMP-2和（或）低表達TIMP-2，降解Ⅳ型膠原，破壞基底膜，從而有助于腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移。國內(nèi)許可慰等[11]研究報道HER-2與MMP-2的表達密切相關(guān)，兩者在膀胱癌的浸潤性生長和轉(zhuǎn)移過程中相互促進。實驗結(jié)果表明，TIMP-2陽性表達與惡性腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈負相關(guān)，與患者生存率呈正相關(guān)，MMP-2和TIMP-2在惡性腫瘤組織中的表達呈負相關(guān)，TIMP-2可通過對MMP-2的抑制作用，成為惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的阻抑因素。MMP-2和TIMP-2作為分子生物學(xué)指標(biāo)，聯(lián)合檢測能更有效地判定早期惡性腫瘤患者的預(yù)后，以便為患者選擇更合理的治療[12，8]。

3.3 癌旁組織癌標(biāo)的表達與癌復(fù)發(fā)的關(guān)系 癌旁組織易發(fā)生不同程度的惡變傾向，是否癌變及癌變的范圍大小，不僅與腫瘤的惡性程度有關(guān)，亦影響手術(shù)方式的選擇及治療后的效果[1]。Igawa[13]通過美藍對膀胱黏膜進行染色后取組織進行組織病理學(xué)檢查的結(jié)果表明，Ta、T1膀胱癌癌旁組織的組織病理學(xué)有惡變傾向的惡變率為21.1%，T2惡變率50.0%，T3惡變率64.7%。淺表性膀胱癌癌旁組織距癌緣2 cm處有癌變及癌前病變占20%左右，其中距癌緣2 cm處原位癌和異型增生各占1/2。浸潤性膀胱癌癌旁有癌變及癌前病變高達50%以上，癌變組織距癌緣2 cm以外占20%以上；T2浸潤性癌距癌緣2 cm以外接近20%，T3浸潤性癌距癌緣2cm以外接近30%；其中癌旁癌變、原位癌和不典型性增生約各占1/3。國內(nèi)馬文香等[14]對26例膀胱癌進行圖像分析，主要以癌旁原位癌為主。在行膀胱癌手術(shù)時，不僅要考慮腫瘤的浸潤深度，更要高度重視手術(shù)切除范圍；在2 cm處發(fā)現(xiàn)惡變，提示在行膀胱部分切除術(shù)時要擴大切除范圍。對于T3 G3期膀胱移行細胞癌應(yīng)多以膀胱全切為主，對于分級、分期稍低的膀胱癌若行膀胱部分切除術(shù)亦應(yīng)擴大切除范圍才獲得較好的預(yù)后。

本研究采用免疫組化方法測定膀胱移行細胞癌組織中MMP-2和TIMP-2的表達，并以正常膀胱黏膜組織為對照。結(jié)果顯示在正常膀胱組織中MMP-2和TIMP-2不表達；而在膀胱癌組織中，兩者均呈局灶狀或斑片狀表達。MMP-2的陽性表達與臨床分期、分級呈正相關(guān)；TIMP-2的陽性表達與臨床分期、分級相關(guān)不顯著，MMP-2表達普遍高于TIMP-2表達。本組實驗證實BTCC組織和癌旁組織中MMP-2的表達率與膀胱癌1年內(nèi)復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)；BTCC組織和癌旁組織中TIMP-2的表達率與膀胱癌1年內(nèi)復(fù)發(fā)率呈負相關(guān)。MMP-2失去TIMP-2對它的抑制，能夠順利降解Ⅳ型膠原，破壞基底膜，從而有助于腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移。MMP-2和TIMP-2兩者表達失衡，導(dǎo)致癌細胞周圍基底膜降解、為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移提供了便利條件。MMP-2和TIMP-2的表達失衡也是膀胱癌在膀胱部分切除術(shù)后短期內(nèi)復(fù)發(fā)的原因之一。

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