高效液相定量分析0.01%蕓苔素內酯可溶液劑

喬紀偉 郝紅英 姚家元 宋 彬 呂建偉

上海綠澤生物科技有限責任公司 （上海 201611）

蕓苔素內酯（brassinolide），化學名稱（22R,23R,24R）－2α,3α,22,23－四羥基－β－均相－7－氧雜－5α－麥角甾烷－6－酮，相對分子質量（按2007國際相對原子質量計）為480.7，結構式見圖1。

圖1 蕓苔素內酯結構式

植物各個階段的生長發育是受自身激素的控制和調節的。蕓苔素內酯作為新一類植物內源激素，其化學結構和植物性激素極為相近，在很低的濃度下，能明顯地增加植物的營養體生長和促進受精作用、增加光合作用強度、增強根系活力、促進根系發育、提高葉綠素含量、延緩葉片衰老、抗倒伏能力增強、提高作物產量，改善作物品質。

有關蕓苔素內酯的定量分析，目前尚未見公開報道。本實驗采用反相高效液相色譜，使用TC－C18為填料的不銹鋼柱和紫外檢測器，對蕓苔素內酯進行定量分析，方法簡便、快速、準確，分離效果好，方法的準確度及精密度均能達到定量分析的要求，適用工業化生產和質量分析。

1 實驗部分

1.1 試劑和溶液

吡啶：分析純；1－萘硼酸：97%分析純；乙腈：色譜純；水：新蒸二次蒸餾水；蕓苔素內酯標樣：質量分數98.0%（市售）；0.01%蕓苔素內酯可溶液劑（由某企業提供）。

1－萘硼酸溶液：稱取0.04g（精確至0.1mg）1－萘硼酸于100mL容量瓶中，加吡啶溶解并稀釋至刻度，搖勻。

流動相：乙腈+水＝85＋15（體積比），于超聲波浴中脫氣10min,再用0.45μm微孔濾膜過濾。

1.2 儀器

高效液相色譜儀：島津10Avp,具有可變波長的紫外檢測器；色譜數據處理機；色譜柱：250mm×4.6mm(id)不銹鋼柱，內裝 TC－C18填充物，粒徑 5μm；微孔濾膜：0.45μm；微量進樣器：25μL；超聲波振蕩器。

1.3 色譜操作條件

流速：1.0mL/min；柱溫：40℃（溫差變化不大于2℃）；檢測波長：290nm；進樣體積：5μL；保留時間：蕓苔素內酯異構體1約13.0min、蕓苔素內酯異構體2約13.9min、蕓苔素內酯異構體3約15.1min、蕓苔素內酯異構體4約16.1min。

上述操作條件系典型操作參數，可根據不同儀器特點作適當調整，以獲得最佳分離效果。標樣與試樣溶液高效液相色譜圖見圖2、圖3所示。

1.4 測定步驟

1.4.1 標樣溶液的配制

稱取蕓苔素內酯標樣0.02g（精確至0.02mg），置于50mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。準確移取5mL標樣溶液于50mL容量瓶中，加入5mL 1－萘硼酸溶液，搖勻，于70℃反應30min，取出，恢復至室溫后用乙腈稀釋至刻度，搖勻。

1.4.2 試樣溶液的配制

稱取試樣10g（精確至0.02mg）于25mL容量瓶中，加入5mL 1－萘硼酸溶液，搖勻，于70℃反應30min，取出，恢復至室溫后用乙腈稀釋至刻度，搖勻。

標樣溶液和試樣溶液在70℃時反應30min要同步進行。

1.4.3 測定

在上述操作條件下，待儀器基線穩定后，連續注入數針標樣溶液，計算各針響應值，待相鄰兩針相對響應值變化小于1.5%時，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

1.4.4 計算

將測得的兩針試樣溶液以及試樣前后兩針標樣溶液中蕓苔素內酯的峰面積分別進行平均。蕓苔素內酯質量分數 X（%），按式（1）計算：

式中：A1—— 標樣溶液中蕓苔素內酯異構體1、2、3、4峰面積之和的平均值；

A2——試樣溶液中蕓苔素內酯異構體1、2、3、4峰面積之和的平均值；

m1——蕓苔素內酯標樣的質量，g；

m2——試樣的質量，g；

P——蕓苔素內酯標樣的質量分數，%；

20——稀釋因子。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

分別使用不同比例的甲醇、乙腈、水作為流動相，對試樣進行分離條件選擇，結果表明，用乙腈＋水＝85＋15（體積比）作為流動相，分離效果好，出峰時間適中，峰形對稱，滿足分析要求。

2.2 檢測波長的選擇

根據反復篩選，蕓苔素內酯在290nm波長處有較大的紫外吸收，且在該波長下對乙腈、衍生化試劑均無吸收，確定其為測定波長。

2.3 方法的線性關系試驗

配制已知高濃度標準液經1－萘硼酸衍生化后，移取不同濃度的標準溶液至各容量瓶中，定容至相同體積，搖勻。在1.3節表明的操作條件下進行測定，得到相應的峰面積，見表1。

表1 蕓苔素內酯濃度與峰面積的線性關系

以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標作圖,得到一條直線，線性關系良好，如圖4所示。得到回歸方程：Y＝3425.4X－9270.9，其相關系數 r＝0.9997。

2.4 方法的精密度試驗

取一經衍生化后的試樣，按本標準1.3節方法對同一樣品進行7次平行測定，測定相對標準偏差RSD，結果見表2。

表2 蕓苔素內酯測定方法的精密度試驗

2.5 方法的準確度試驗

稱取已知含量的試樣及已知質量的標準品，分別加入1－萘硼酸衍生化試劑，在70℃下保溫30min,同時取出冷卻至室溫，用移液管移取5份樣品于25mL容量瓶中，按配制值分別精確移入標準液，組成5份不同濃度的蕓苔素內酯加標溶液，用乙腈稀釋至刻度，搖勻后按1.3節操作條件下進行測定，根據試液配制值與峰面積，分別計算5份加標液回收率，結果見表3。

表3 方法回收率試驗

3 結論

（1）根據表1所示蕓苔素內酯濃度與響應值線性關系，測得線性范圍在19.6～196μg/mL之間，相關系數r＝0.9997。符合CIPAC《確認農藥制劑分析方法準則》要求，相關系數r≥0.99。

（2）根據表2所示經7次重復測定試驗，平均值為0.0099%，依據CIPAC相對標準偏差RSD≤2(1-0.5logC)×0.67，當濃度為0.0099%時RSD應為2.68，實測變異系數RSD為2.27，可被CIPAC準則要求所接受。

（3）根據表3實測結果，方法回收率在98.9%～107.4%之間，CIPAC要求當被測物濃度＜0.1%時，回收率可在75%～125%之間。此驗證結果符合CIPAC準則要求。

采用高效液相色譜法分析蕓苔素內酯0.01%可溶液劑含量，其線性關系、精密度、準確度均符合CIPAC要求，檢測方法簡便、快速，能滿足工業化生產和質量控制要求。

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