肝腸鈣粘連蛋白對人肝癌細胞株Hep3B生長的影響

鄭州大學第一附屬醫院肝膽外科（鄭州450052） 范正軍 彭 飛 薛建峰 程 波 劉艷杰

目前國內外對原發性肝癌（PLC）的發病機制的研究涉及多發面、多層次的內容，從分子生物學水平來說，其發生、發展、侵襲和轉移與多基因突變、細胞信號轉導通路和異常新生血管增生等密切相關。已有學者研究指出肝腸鈣粘連蛋白（LI－cadherin）與肝癌細胞的生長、轉移和侵襲性相關，但具體機制尚未闡明［1］，本文應用si RNA干擾技術下調人肝細胞肝癌細胞株Hep3B中 LI－cadherin的表達，研究 LI－cadherin對人肝癌細胞增值的影響，并初步探討其機制。

材料與方法

1 材 料 Hep3B人肝癌細胞株購自于上海漢博生物科技有限公司，脂質體Lipofectamine T M，2000、TRIzol試劑盒購自于美國Invitr ogen公司，氨芐青霉素、RPMI1640培養基、溴化乙錠（EB）、胰酶細胞消化液、DNA Ladder Mar ker購自于大連寶生物工程有限公司，膠回收試劑盒、10%胎牛血清（FBS）、G418購自于GIBCO公司，低熔點瓊脂糖粉購自于英國Oxoid公司，LI－cadherin Si RNA（sc－43014）、Contr ol Si RNA（sc－37007）、Wester n blotting 檢測試劑盒購自于美國Santa公司，二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮哇鹽（MTT）購自于美國Sig ma公司，蛋白提取試劑盒、蛋白提取緩沖液購自于北京天恩澤基因科技有限公司。LB培養基、RPMI－1640細胞培養液、50×（Tris－AC）電泳緩沖液（TAE）、瓊脂糖電泳凝膠、100μg/ml氨芐青霉素、MTT溶液、PI染液、0．25%胰蛋白酶消化液、Transfer buffer for wester n bl otting（1000 ml），所有實驗試劑均嚴格按照說明書仔細配置。

2 方 法 ①細胞培養及LI－cadherin轉染：將Hep3B細胞于37℃含10%PBS的培養液中解凍，加入10 ml RPM－1640培養液制成細胞懸液，于37℃含5%CO2孵箱培養、10 ml含10%胎牛血清但不含抗生素的培養液培養，胰蛋白酶液消化傳代，取對數生長期細胞為實驗對象。si RNAs轉染用 Lipofectamine T M2000脂質體并嚴格按照操作說明書的轉染條件及步驟進行細胞基因轉染，72h后收獲細胞進行檢測和實驗。按照轉染內容的不同進行細胞分組，即LI－cadherin轉染組：轉染LI－cadherin特異性Si RNA；陰性對照組：加入等量的轉染試劑并轉染同濃度的非干擾si RNA；空白對照組：常規培養的人肝癌細胞株Hep3B。②實驗組LI－cadherin及Cyclin D1蛋白表達的變化：采用 Western－blotting法檢測各實驗組LI－cadherin及Cyclin D1蛋白表達的變化情況。各組蛋白樣品提取后，根據待測的蛋白分子量的不同分別灌以不同濃度的的積層膠和分離膠，按照 Western－blotting法實驗步驟嚴格操作。③LI－cadherin對肝癌細胞Hep3B生長的作用：利用 MTT法重復三次分別檢測Li－cadherin－Si RNA轉染組細胞、陰性對照及空白對照組在490nm波長下細胞第12h、24h、36h、48h、72h及96h 6個時間點的光吸收值（OD值），并記錄結果進行統計學分析，最后以時間作為橫軸，光吸收值為縱軸繪制各組細胞的生長曲線。④檢測各實驗組細胞周期：將瞬時轉染后72h正處于對數生長期的3組細胞分別以1×106接種到6孔板，每組細胞接種3孔，長至80%匯合度，棄去培養液，用3 ml PBS緩沖液小心洗滌兩次，0．25%胰蛋白酶－EDTA消化液消化后制成細胞懸液，加入PI（100μg/ml）和5μl Rnase，37℃恒溫箱內靜置30 min，使用美國BD公司Epics－XLⅡ型流式細胞儀（FCM），通過FSC/SSC散點圖收集10000個細胞，采用設門技術排除粘連細胞和細胞碎片，由Cellquest軟件分析G0/G1，S，G2/M期細胞含量百分比，并分析細胞的增殖指數：PI［14］＝（S＋G2/M）/（G0/G1＋S＋G2/M）×100%。

結 果

1 轉染Si RNA后轉染效率觀察 利用熒光倒置顯微鏡分別觀察三組細胞，發現轉染入Si RNA后的Hep3B細胞中可見清晰的熒光，說明轉染成功。計算視野內發出熒光的細胞占全部細胞的85%，即轉染效率為85%，符合本實驗的基本條件。見圖1。

圖1 LI－cadherin－Si RNA轉染 Hep3B細胞的效率

2 轉染Si RNA后LI－cadherin與細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表達 轉染后普通培養72h，通過Wester n－blotting檢測發現空白對照組、空質粒轉染組的LI－cadherin的蛋白表達率無明顯差異（P＞0．05），Si RNA轉染組LI－cadherin的表達均低于空白對照組、空質粒轉染組，說明LI－cadherin抑制有效；Si RNA轉染組與空白對照組、空質粒轉染組相比，Cyclin D1蛋白表達明顯升高。見圖2。

圖2 Si RNA轉染Hep3B細胞后LI－cadherin及Cyclin D1的表達

3 LI－cadherin對肝癌細胞生長的作用 見表1。通過MTT方法分別檢測6個時間點發現，Si RNA轉染組在12h、24h、36h時陰性對照組和空白對照組細胞均開始了增值，轉染組生長高于空白對照組和空質粒轉染組，但是在統計學上無顯著性差異（P＞0．05），48h、72h、96h肝腸鈣粘連蛋白Si RNA轉染組細胞株生長明顯加快，明顯高于空質粒轉染組和空白對照組，具有統計學意義（P＜0．05）。見圖3。

表1 LI－cadherin對肝癌細胞株Hep3B生長的作用（n＝6）

圖3 LI－cadherin對肝癌細胞生長的作用

4 流式細胞儀檢測肝腸鈣粘連蛋白對肝癌細胞周期的影響 見表2。Si RNA轉染組 Hep3B－LI－cadherin－Si RNA細胞與空白對照組和空質粒轉染組相比S期及G2/M期百分含量明顯增多，G0/G1期百分含量明顯減少，PI較高，差異均具有統計學意義（P＜0．05）；空白對照組和空質粒轉染組相比各期細胞百分比及PI值變化不大，差異無統計學意義（P＞0．05）。Si RNA轉染組與空白對照組和空質粒轉染組相比Cyclin D1蛋白的表達明顯升高（P＜0．05），而空白對照組和空質粒轉染組Cyclin D1蛋白變化無明顯差異（P＞0．05）。此結果提示下調LI－cadherin的表達后，明顯增加了Cyclin D1蛋白的表達，同時促進G1向S期轉化，加快細胞的分裂、促進細胞增殖。

表2 CDH17對肝癌細胞周期的影響

討 論

經典鈣粘連蛋白的細胞質的鈣連環部分由150個氨基酸殘基組成，是一個基因序列高度穩定的保守區域，而肝腸鈣粘連蛋白的細胞質的鈣連環片段卻僅由20個氨基酸殘基組成，其基因結構上決定其是不穩定區域，同時發現LI－cadherin的細胞質肌動蛋白（actins）和鈣粘連環蛋白（catenins）之間的相互作用表達受限和異常減少［2］。有研究表明，LI－cadherin在直腸癌、胃癌等多種上皮源性腫瘤組織及腫瘤組織周圍有表達，并發現LI－cadherin與腫瘤細胞的生長、轉移和侵襲性相關，范正軍等［3］通過對56例直徑不等的肝癌標本研究發現LI－cadherin與肝癌的直徑呈現負相關關系，并表明LI－cadherin可抑制肝癌的生長，相反陳筱婷等［4］利用單克隆抗體技術沉默LI－cadherin基因的表達進而抑制了肝癌細胞株的增殖，在體外證明了LI－cadherin可促進肝癌的生長，但其未做相關機制研究，闡述不夠充分。

目前已有研究證實，多種腫瘤中都存在Cyclin D1基因結構和功能異常，如肺癌［5－6］、食管癌［7］和肝癌［8－9］等，Cyclin D1在腫瘤的診斷、預后以及治療方面的價值可觀，已成為目前惡性腫瘤研究領域中的熱點話題。本實驗通過si RNA技術轉染Hep3B并經蛋白免疫印跡檢測LI－cadherin蛋白表達證明有效下調后，通過MTT法檢測表明si RNA轉染組細胞在12、24、36h與兩個對照組相比無統計學意義，但是在第36h檢測時已經發現轉染組生長明顯較快，在48h以后則表現出了明顯的差異性，根據實驗結果表明其可抑制肝癌細胞的生長。通過研究3組細胞在培養第72h表現出生長顯著差異性時，利用流式細胞術檢測細胞周期并通過DNA含量的不同計算各時相的比例發現，下調LI－cadherin表達的轉染組G0/G1期占細胞周期含量分布的23．18%，較對照組低，S期占45．37%以及G2/M期占30．59%，均較對照組高，增值指數（P I）達77%也顯著高于對照組，表明生長明顯增快的Si RNA轉染組生長分數較高，而對照組生長分數較低。通過對比各組細胞各細胞周期分布的不同，我們進一步在實驗中檢測調節G1/S期的細胞周期蛋白D1，發現轉染組CCND1表達量明顯高于對照組，因此我們推測，特異性沉默Hep3B細胞的LI－cadherin基因后，其生長速度增快，很可能是因為LI－cadherin基因的沉默刺激了CCND1基因的改變并過度表達，使G0期靜止的激活進入S期，且縮短了G1期，加速進入S期，促進了腫瘤的快速生長，同時間接說明肝腸鈣粘連蛋白可能通過細胞周期蛋白D1調控細胞周期而起到抑制肝癌細胞增殖的作用。

［1］范正軍，房祥杰，王家祥，等．肝腸鈣粘連蛋白對人肝癌細胞粘附和遷移的作用［J］．中華實驗外科雜志，2011，28（8）：1396．

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［3］范正軍．肝腸鈣粘連蛋白與肝細胞癌的關系及對粘附和侵襲作用的初步研究［D］．鄭州大學外科學，2011．

［4］陳筱婷，杜紅延，原少斐，等．肝腸鈣粘連蛋白單克隆抗體的制備及其對Hep G2的生長抑制作用［J］．南方醫科大學學報，2009，29（5）：880－883．

［5］Hirsch FR，Witta S．Bio mar kers for prediction of sensitivity to EG2FR inhibitors in non－s mall cell lung cancer［J］．Curr Op in Oncol，2005，17（2）：118－122．

［6］Hirsch FR，Witta S．Bio mar kers for prediction of sensitivity to EG2FR inhibitors in non－s mall cell lung cancer［J］．Curr Op in Oncol，2005，17（2）：118－122．

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