牙鲆IGF-IR基因5′調控區的克隆及功能初步分析

張俊玲 施志儀 程 琦 陳曉武 王曉竹

(上海海洋大學農業部淡水水產種質資源重點實驗室, 上海 201306)

胰島素樣生長因子-I 受體(Insulin-like growth factor-I receptor, IGF-IR)是一種跨膜的酪氨酸激酶受體蛋白, 是IGF-I生物功能的關鍵調節因子之一。當配體IGF-I與其結合時激活酪氨酸激酶活性, 從而引起大多數細胞的促有絲分裂和抑制凋亡效應, 在細胞的正常生長和分化中起至關重要的作用。在生物體內,IGF-IR基因的表達受到多層次的調控, 其中以轉錄水平的調控為主。人IGF-IR基因的啟動子是一個不含TATA框和CAAT框、高GC含量、“initiator” 型的啟動子。P53、SP1、KLF16、c-Jun、ER-α和WT1等均是人IGF-IR基因5′調控區已鑒定的轉錄因子[1—4]。但是在低等生物包括魚類中,IGF-IR基因的5′調控區序列及啟動子特征很少有報道。

越來越多的研究表明, IGF-I通過與其受體IGF-IR結合在魚類生長、發育、代謝、繁殖、滲透壓調節及免疫等眾多生理過程中發揮重要作用[5—7]。牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我國重要的海水養殖魚類之一, 也是變態發育、繁殖及內分泌生理研究較為集中的魚類物種。我們先前的研究分析了IGF-I及IGF-IR在牙鲆發育生長過程中的時空表達及其與甲狀腺激素(Thyroid hormone, TH)的作用關系[8,9], 因而在此基礎上, 本研究克隆了牙鲆IGF-IR基因的 5′調控區序列, 并預測了其潛在的轉錄因子結合位點, 初步檢測了該序列的啟動子活性, 為深入研究魚類IGF-IR基因的轉錄水平調控及探討TH對其基因表達的調節提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

牙鲆成魚購自上海市銅川路水產品市場, 解剖取其肌肉組織, 無菌水沖洗干凈后立即用于基因組 DNA 的提取。DNA 提取試劑盒購自 Beyotime 公司, 膠回收試劑盒、質粒小提取試劑盒、無內毒素質粒大提取試劑盒、Lipofect Transfection Reagent、感受態細胞 DH5α、X-gal、IPTG、DNA Marker購自Tiangen 公司; pAcGFP1-1 載體購自 Clontech 公司; Genome Walking Kit、LATaq酶、限制性內切酶SalI、EcoR I、pMD18-T 載體、T4 DNA Ligase購自Takara 公司。LB培養基、抗生素購自上海生工生物工程技術公司, DMEM 培養基購自 GIBCO 公司, 0.25%胰酶-EDTA購自 Invitrogen 公司, 小牛血清購自杭州四季青公司, 293細胞購自中科院細胞庫。

1.2 實驗方法

基因組DNA 的提取 取約25 mg 的牙鲆肌肉組織, 剪切成盡可能小的碎片, 然后按照基因組 DNA小量抽提試劑盒說明書操作步驟提取基因組 DNA, 經紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性, 并計算其濃度和純度。

5′調控區的擴增 根據已知的牙鲆IGF-IRcDNA(GI： 18150107)5′UTR 序列設計三條特異性引物, GSP1：5′-CCTGGTGGTAACAACTGAGAATA-3′, GSP2： 5′-AGC AGCCTCCACAGAACAT-3′, GSP3： 5′-AATGGCGAGGA AGGGTGG-3′。接頭引物 AP1、AP2、AP3、AP4 由 Genome Walking Kit 提供。

采用基于熱不對稱PCR的染色體步移技術擴增5′調控區序列。取適量基因組 DNA作為模板, 以接頭引物AP(四種中的任意一種, 本研究經預實驗選用的是 AP1)作為上游引物, 分別以IGF-IRGSP1、GSP2 和GSP3 作為下游引物, 進行三輪 PCR, 具體操作按照 Takara 公司的Genome Walking Kit說明書進行。擴增產物經過1%的瓊脂糖凝膠電泳, 回收目的片段經過純化、連接pMD18-T載體、轉化 DH5α。藍白斑篩選, 挑取陽性克隆, 經過菌落 PCR驗證確實有大小正確的插入片段后進行測序, 測序由上海生工生物工程技術公司完成。

5′調控區的生物信息學分析 利用 3種基因啟動子在線分析軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/promoter/)、(http：//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) 和 (http：//bimas.dcrt.nih.gov/mol bio/proscan/) 預測啟動子區域結構特征, 利用 TFSEARCH程序(http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) 對轉錄因子數據庫 TRANSFAC(http：//transfac.gbf.de/TRANSFAC/)進行搜索, 尋找可能的轉錄因子結合位點。

重組報告基因表達載體pAcGFP1-IR的構建 根據 pAcGFP1-1 載體多克隆位點設計引物, 通過 PCR 擴增在牙鲆IGF-IR基因 5′調控序列兩端加上酶切位點。IR913EcoR I ： 5′-GCGGAATTC ACAGACAGAGGGAC-3′,IR913Sal I： 5′-CGCGTCGAC AATGGCGAGGAAG-3′, 其中下劃線為引物中引入的酶切位點SalI和EcoR I, 斜體為保護堿基。

擴增產物首先經過純化、連接 pMD18-T 載體、轉化DH5α, 藍白斑篩選、挑取陽性克隆、抽提質粒DNA。采用SalI、EcoR I 進行37℃ 雙酶切鑒定, 確定是否包含IGF-IR基因 5′ 調控區片段及載體序列(大小分別為 913 bp 和 2.6 kb)。將鑒定正確的 PCR產物、啟動子缺失的pAcGFP1-1 載體分別進行雙酶切, 37℃過夜, 酶切產物回收后經T4 DNA Ligase 16℃連接過夜。連接產物轉化DH5α, 37℃平板培養, 挑取陽性克隆, 雙酶切驗證重組載體。然后送上海生工生物工程技術公司測序驗證。

pAcGFP1-IR的瞬時轉染 將經鑒定正確的pAcGFP1-IR 重組質粒轉化大腸桿菌DH5α, 培養200 mL菌液, 使用無內毒素質粒大提試劑盒提取不含內毒素的pAcGFP1-IR 重組質粒, 抽提步驟按照 TIANGEN 公司的無內毒素質粒大提試劑盒說明書進行, 用于細胞轉染。

293 細胞置于37℃, 5% CO2的培養箱中常規培養。轉染前一天, 胰酶消化細胞并計數, 取2×105細胞鋪板在0.5 mL含血清、不含抗生素的正常生長的培養基中, 使其在轉染時細胞密度為90%—95%。使用24孔板進行轉染實驗, 操作步驟按照 Tiangen 公司的 Lipofect Transfection Reagent說明書進行。分別在轉染24h、48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白報告基因的瞬時表達情況并拍照。

2 結果

2.1 牙鲆 IGF-IR基因5′調控區的克隆

以牙鲆基因組DNA 為模板, 分別以IGF-IR基因的GSP1、GSP2、GSP3和AP1 為引物, 經過三輪 PCR擴增得到一段 936 bp的IGF-IR5′ 調控區序列(圖 1)。

2.2 牙鲆 IGF-IR基因 5′調控區的序列分析

對克隆得到的牙鲆IGF-IR5′ 調控區序列進行生物信息學分析發現, 該序列有潛在的啟動子區。如圖2所示, 將評分為1.00的潛在啟動子區起始子“A”規定為轉錄起始位點 TSS, 它位于翻譯起始密碼子 ATG上游的?637位, 該啟動子既有典型的 TATA 框, 又含有“initiator”序列, 但無CCAAT框; 評分為0.98的潛在啟動子區位于規定TSS上游的?589位, 無TATA和CCAAT框。搜索TRANSFAC 數據庫, 找到93處最佳相互匹配的轉錄因子結合位點, 其中AP1、AP2、C/EBP、p300、E2F、多個 Sp1及c-Myb、Brn2、Oct-1、ER、GR、PR、MyoD和SRY等是誘導牙鲆IGF-IR基因轉錄的潛在作用因子。

2.3 牙鲆IGF-IR 5′調控序列的啟動子活性檢測

采用脂質體介導的轉染方法, 將構建成功的pAcGFP1-IR轉染293細胞, 倒置顯微鏡下觀察細胞狀態,可見細胞狀態良好, 未見成片細胞脫落死亡。pAcGFP1-IR重組質粒轉染細胞 24h后, 在倒置熒光顯微鏡下即可觀察到綠色熒光信號(圖3A), 48h后可觀察到綠色熒光信號增強(圖3B)。陽性對照采用轉染pEGFP-N1質粒(圖3C),陰性對照為轉染啟動子缺失的 pAcGFP1-1載體, 無綠色熒光表達(圖3 D)。

圖1 牙鲆 IGF-IR 基因 5′ 調控區序列克隆Fig.1 5′ regulatory sequence cloning of IGF-IR gene from Japanese flounder by the technique of genome walking

3 討論

本研究采用了一種基于熱不對稱 PCR的染色體步移技術獲得牙鲆IGF-IR基因的5′調控區[10], 它可根據已知基因的 5′UTR序列設計三條同向且退火溫度較高的特異性引物即 GSP1、GSP2和GSP3, 與試劑盒提供的四種經過獨特設計的退火溫度較低的兼并引物即AP1、AP2、AP3和AP4進行熱不對稱PCR反應, 通過三次巢式PCR即可獲取已知序列的側翼序列, 與以往傳統方法相比, 具有高效、簡便、特異性高等優點。為此, 本研究成功獲得了一段936 bp大小的牙鲆IGF-IR基因5′調控區序列。經生物信息學分析發現, 獲得的牙鲆IGF-IR基因5′調控區有2處潛在的轉錄起始位點, 其中位于翻譯起始密碼子ATG上游的?637位的區域評分較高, 且含有“initiator”序列, 無 CCAAT 框, 與人和小鼠IGF-IR基因的“initiator” 型啟動子較相似[11—13], 不同的是除“initiator” 序列外,該區域還含有傳統的 TATA框, 屬含有TATA框和Inr的啟動子, 這樣TBP本身能結合于啟動子的TATA框, 也可同TFDⅡ中的 TAF Ⅱ亞基一起結合。此外, 預測的第二處潛在轉錄起始位點前后序列與哺乳動物差異較大。本研究通過與綠色熒光蛋白報告基因表達載體重組, 脂質體介導瞬時轉染 293細胞, 初步表明該序列具有啟動子的活性。

轉錄因子結合位點預測發現, 牙鲆IGF-IR基因5′調控區不僅含有E2F、C/EBP、p300、AP2等潛在的轉錄因子, 還有較多的Sp1可能結合位點, 這與在人和小鼠中是相一致的[11—13]。轉錄因子 Sp1能和GC盒相結合, 在SC40啟動子中有多個GC盒,它們均能和Sp1相結合, 然而含有GC盒的不同的DNA順序與 Sp1的親和力卻各不相同。體外瞬時轉染實驗也表明Sp1能激活IGF-IR基因的表達[14]。重要的是, 本研究發現牙鲆IGF-IR基因5′調控區分布有ER、GR、PR、MyoD、Oct-1、c-Myb、Brn2、SRY等潛在的轉錄因子結合位點, 這些轉錄因子大多也在人和小鼠IGF-IR基因 5′調控區存在, 提示IGF-IR基因的轉錄調節元件在哺乳動物和魚類中是相對保守的。其中ER、GR、PR和TR同屬配體依賴型的核受體轉錄因子家族, 識別的半位點序列類似。有研究發現, 如果將ER和TR轉錄因子共轉染CV1細胞, 當添加TH時會減弱雌激素響應的靶基因轉錄,且這種抑制效應具有配體依賴性, 使用不同亞型的TR(TRαA、TRαB、TRβ1 和 TRβ2)效應也不同[15]。在大多數組織細胞中, ER、GR、PR和 TR以及 RXR、VDR等核受體轉錄因子是共表達的, 因而它們之間可以形成“異二聚體”激活特定基因轉錄; 當某種激素或轉錄因子水平過高時, 彼此間產生競爭性抑制如ER和TR似乎也是很有可能的。因此, 盡管在克隆的牙鲆IGF- IR基因5′調控序列范圍內尚未發現潛在的 TR結合位點(不排除在更上游存在這一位點的可能), 但甲狀腺激素仍有可能通過上述核受體轉錄因子影響IGF-IR基因的表達。

圖2 牙鲆IGF-IR 基因5′調控區序列及潛在的轉錄因子結合位點Fig.2 Sequences and potential transcript binding sites of 5′ regulatory region ofIGF-IR gene from Japanese flounder

圖3 pAcGFP1-IGF-IR在293 細胞中的表達Fig.3 Expression of pAcGFP1-IGF-IR in 293 cells

此外, MyoD 與 Myogenin、Myf5、MRF4 同屬bHLH(basic helix-loop-helix)家族, 是專一性的生肌調節因子, 在肌肉發生與分化中起重要作用。研究表明MyoD基因調控區具有TR作用元件, 是甲狀腺激素直接響應的基因, TH可通過調節MyoD的表達而調控肌肉的形態發生[16,17]。Oct-1是調控真核細胞生長的重要因子, 一旦Oct-1表達降低將會引起細胞周期停滯, 細胞暫時退出細胞周期并開始形態分化[18]。Dowling,et al.[19]在小鼠中發現當妊娠期內源甲狀腺激素尚未分泌之前, T4處理能增加Oct-1 mRNA的表達; 并且從胎兒到成體期, TH均能調節Oct-1的表達。c-Myb起初被鑒定為原癌基因, 在未成熟的造血細胞表達量很高, 當細胞進行分化時其表達明顯降低, 是一種調控細胞增殖的重要轉錄因子[16]。Brn2是調節表皮角質細胞分化的轉錄因子[20], 還可使皮膚成纖維細胞轉化為神經細胞[21]。而SRY則為性別決定基因,它在牙鲆IGF-IR基因調控區的潛在出現提示了IGF-I可能與魚類性別分化有關。

綜上所述, 這些潛在轉錄因子的發現進一步支持了牙鲆IGF-I及受體基因在細胞周期調控、促進細胞分化與生長中發揮重要作用, 同時還暗示了甲狀腺激素很有可能通過調節這些轉錄因子的表達而影響 IGF-I/IGF-IR系統的生物學功能。

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