中國(guó)藍(lán)藻植物的新記錄屬—擬甲色球藻

劉 洋 朱夢(mèng)靈 徐 瑤 虞功亮 李仁輝

(中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢430072)

擬甲色球藻(Chroococcidiopsis)是 Geitler 在1933年建立的單細(xì)胞群體藍(lán)藻, 在現(xiàn)代四目藍(lán)藻分類系統(tǒng)中[1], 它屬于色球藻目、異球藻科(Xenococaceae)。擬甲色球藻在全球分布廣泛, 從南極的巖石縫隙到印度尼西亞的熱泉, 以及世界各地的炎熱沙漠或山洞中都曾發(fā)現(xiàn)過(guò)[2—6], 而且在熱帶的草原上發(fā)現(xiàn)它們存在于地衣共生系統(tǒng)中[7]。擬甲色球藻的一些種類能長(zhǎng)期抗干旱和電離輻射[8], 為此美國(guó)國(guó)家航空航天局的一些科學(xué)家就希望通過(guò)研究使其成為火星的拓荒者。另外, 一些擬甲色球藻種類則生活在水體中, 包括淡水、海水、高鹽度水體[9]。目前,國(guó)際上對(duì)擬甲色球藻的關(guān)注多集中在對(duì)荒漠等極端環(huán)境下的研究, 水體中也是以溫泉為主的報(bào)道。我們最近在太湖進(jìn)行藍(lán)藻水華的調(diào)查和研究時(shí), 發(fā)現(xiàn)了擬甲色球藻存在于太湖水體中, 通過(guò)對(duì)野外水體樣品的分離培養(yǎng), 獲得了擬甲色球藻單種培養(yǎng)藻種。通過(guò)對(duì)野外樣品以及單種培養(yǎng)藻種的形態(tài)觀察和聚類分析, 確認(rèn)為擬甲色球藻(Chroococcidiopsis)的藻種, 這是尚未在中國(guó)報(bào)道過(guò)的新記錄屬。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

采集地點(diǎn)為地處于江蘇省宜興大浦鎮(zhèn)附近的西太湖, 坐標(biāo)為N31°06′8.70″E 120°0′5.90″, 用 25號(hào)篩絹制作的浮游生物網(wǎng)采集藻類樣品。

1.2 藻種分離

用毛細(xì)管分離法： 將滅菌后的巴斯德吸管制作成毛細(xì)管(Pasteur Micropipette), 在解剖鏡下挑取單個(gè)群體, 清洗6—8次后[10], 最后放入含有2 mL CT培養(yǎng)基[11]的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(無(wú)菌)中, 培養(yǎng)溫度為25, ℃白色燈光為光源, 光照強(qiáng)度為25 μE/(m2·s),光照周期為12h∶12h (L∶D)。本研究使用的藻株編號(hào)為 CHAB1690, 藻種保存于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所有害藻類學(xué)科組藻種庫(kù)。

1.3 形態(tài)觀察和測(cè)量

藻細(xì)胞形態(tài)的觀察使用Nikon eclipse 80i型光學(xué)顯微鏡, 外接數(shù)碼相機(jī)(DS-Ri1)與臺(tái)式計(jì)算機(jī)。數(shù)碼拍照和數(shù)據(jù)測(cè)量通過(guò)其附帶的圖像分析軟件NIS-Elements D 3.2實(shí)行。選取50個(gè)以上的藻體進(jìn)行各項(xiàng)數(shù)據(jù)的測(cè)量統(tǒng)計(jì)。

1.4 16S rRNA基因序列測(cè)定和分子系統(tǒng)分析

對(duì)分離的藻株培養(yǎng)富集后, 進(jìn)行DNA提取, 方法參考Lin,et al.[12]。用于擴(kuò)增16S rDNA的引物為：27F1(5′-AGAGTTTTGATCCTGGCTCAG-3′)[13]和B23S (5′-CTTCGCCTCTGTGTGCCTAGGT-3′)[14],由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為 50 μL, 包含 200 mmol/L dNTP; 1.5 mmol/L MgCl2;1×bufferPCR緩沖液; 10 pmol引物; 1 UTaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件為： 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸2min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 通過(guò)膠回收試劑盒回收(BioFlux), 克隆到載體pMD18-T上(Takara, Japan)。將克隆載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中, 菌液送北京華大基因科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序, 測(cè)序后得到兩段序列用BioEdit軟件拼接。序列通過(guò)NCBI的BLAST進(jìn)行比對(duì), 并將獲得序列和從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的基因序列用Clustal X1.83軟件進(jìn)行對(duì)位排列。運(yùn)用分子進(jìn)化遺傳分析軟件 MEGA5.0基于 Kimura two-parameter模型構(gòu)建鄰接法關(guān)系樹(NJ tree), 步展值(Bootstrap value)設(shè)為1000, 空位或缺失位點(diǎn)均當(dāng)作配對(duì)刪除(Pairwise deletion)處理, 以Gloeobacter violaceusPCC 7421 為外類群。

2 結(jié)果

2.1 擬甲色球藻屬Chroococcidiopsis形態(tài)特征

擬甲色球藻屬(Chroococcidiopsis)由 Geitler建立于 1933年, 現(xiàn)在的分類系統(tǒng)中隸屬于藍(lán)藻門(Cyanophyta)、藍(lán)藻綱(Cyanophyceae)、色球藻目(Chroococcales)、異球藻科 (Xenococcaceae), 以溫泉擬甲色球藻(Chroococcidiopsis thermalis)為模式種。本屬目前共報(bào)道過(guò)13個(gè)種[1]。

單細(xì)胞或形成規(guī)則或不規(guī)則的球狀群體。群體具有薄而堅(jiān)實(shí)的無(wú)色膠被(圖 1B中箭頭所指, 子細(xì)胞逃逸后留下的膠被)。群體常常聚集成肉眼可見(jiàn)的片狀。群體直徑為31—57 μm, 平均直徑為40 μm。細(xì)胞球形、半球形或類多邊形, 直徑4—10 μm, 平均直徑為 6.5 μm, 細(xì)胞不規(guī)則分裂, 母細(xì)胞分裂出的子細(xì)胞通常大小形態(tài)各異(圖1C箭頭所指)。原生質(zhì)體綠色, 無(wú)氣囊。同一群體中的細(xì)胞尺寸大小不一, 排列緊密(圖1)。

有些細(xì)胞之后會(huì)變成內(nèi)生孢子(或者某個(gè)群體中的部分細(xì)胞), 不同種類, 其內(nèi)生孢子數(shù)量不同。絕大部分?jǐn)M甲色球藻的內(nèi)生孢子無(wú)運(yùn)動(dòng)特征, 但偶有出現(xiàn), 且運(yùn)行型內(nèi)生孢子的出現(xiàn)取決于環(huán)境因子。分裂后的細(xì)胞或單細(xì)胞會(huì)從裂開(kāi)的膠被中釋放出來(lái), 群體膠被通常透明。

2.2 分子系統(tǒng)分析

利用上述引物擴(kuò)增 16S rRNA 基因, 獲得了2127 bp的序列, GenBank號(hào)為 JX494785。但與GenBank藻株序列進(jìn)行比對(duì)處理后, 截取了最大可使用的 1182 bp構(gòu)建系統(tǒng)樹。 將測(cè)序結(jié)果和通過(guò)Blast比對(duì)得到的相似序列以及目前Genbank中已有的擬甲色球藻16S rRNA基因序列構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(圖2)。太湖的ChroococcidiopsisCHAB1690藻株同兩株歐洲的Chroococcidiopsis藻株(AJ344552和AJ344555)相似度很高(相似度均達(dá)到 99%), 從而聚在一起(圖2)。而目前Genbank收集的擬甲色球藻種類在分子系統(tǒng)樹上歸屬于兩個(gè)類群(I和II), 太湖的藻株則聚在了類群 I, 該類群藻株的最低相似度為88%。另有少數(shù)藻株聚在了較遠(yuǎn)的另一個(gè)類群 II。兩個(gè)類群的最低相似度為86%。

圖1 顯微鏡下Chroococcidiopsis CHAB1690的形態(tài)Fig.1 Morphological image of Chroococcidiopsis CHAB1690

3 討論

單細(xì)胞群體藍(lán)藻異球藻科(Xenococcaceae)在以前五目藍(lán)藻分類系統(tǒng)(色球藻目、厚皮藻目、顫藻目、念珠藻目和真枝藻目)中歸屬于厚皮藻目, 但是最近的藍(lán)藻分類系統(tǒng)還是以四目系統(tǒng)為主流[1]。與擬甲色球藻屬同屬于異球藻科的還有另外 5個(gè)屬(Chroococcidium、Myxosarcina、Xenococcus、Chroococcopsis、Xenotholos), 該屬區(qū)別于其他藻屬的特征是群體具有薄而堅(jiān)固且清晰的膠鞘, 并且群體內(nèi)的細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)排成一列的假絲形態(tài)或階段[1]。中國(guó)擬甲色球藻雖然尚未得到詳細(xì)描述, 但在個(gè)別文獻(xiàn)中也有提及, 且在一些文獻(xiàn)中被譯為擬色球藻[15]。根據(jù)藻屬拉丁名的詞根含義,Chroococcopsis才是擬色球藻, 且已有資料可考[16]。從兩屬的形態(tài)特征比較來(lái)看, 擬甲色球藻屬群體內(nèi)的細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)成列細(xì)胞的假絲形態(tài)或階段, 而在擬色球藻屬(Chroococcopsis)藻株的群體中則會(huì)呈現(xiàn)出成列細(xì)胞扇形分布的現(xiàn)象[1]。擬甲色球藻屬目前報(bào)道有13個(gè)種, 但詳細(xì)描述的僅有 2個(gè)種,其中溫泉擬甲色球藻(Chroococcidiopsis thermalis)為淡水種, 常在溫泉中發(fā)現(xiàn),Chroococcidiopsis fissurarum則生活在海水中。根據(jù)形態(tài)特征, 太湖的擬甲色球藻類似于溫泉擬甲色球藻, 但是此太湖藻種的16S rRNA基因序列同溫泉擬甲色球藻(Chroococcidiopsis thermalisPCC7203)的相似度僅為91%。而同本太湖藻種最為相似的兩歐洲藻種并沒(méi)有確定種名, 并且它們的形態(tài)特征也無(wú)法查閱。所以從生活習(xí)性和16S rRNA基因的序列來(lái)看, 此太湖的種類基本可以排除在Chroococcidiopsis thermalis和Chroococcidiopsis fissurarum之外, 但它是否為一新種, 還是其他的種類還需要大量的深入研究?？傊? 以形態(tài)特征為界定的擬甲色球藻屬并不是一個(gè)單系類群。分子系統(tǒng)學(xué)分析表明, 擬甲色球藻屬的類群 I和類群II中藻株的最低相似度僅為86%, 而類群I內(nèi)部中藻株的最低相似度也不到 90%。根據(jù)屬內(nèi) 16S rRNA序列相似度不低于 95%的原則[17,18], 這兩個(gè)類群中的藻株可能不屬于同一個(gè)屬, 所以目前的擬甲色球藻屬(Chroococcidiopsis)中可能包含了多個(gè)種。對(duì)擬甲色球藻屬分類學(xué)的整理, 需要對(duì)此屬的模式種類(Type species)和模式藻種(Type strain)的準(zhǔn)確確定, 通過(guò)大量的多種特征的比較, 才能建立起一個(gè)自然的擬甲色球藻的分類系統(tǒng), 為異球藻科分類系統(tǒng)的梳理提供條件。我們期待中國(guó)境內(nèi)更多擬甲色球藻屬的藻類的發(fā)現(xiàn), 為其分類學(xué)和其他生物學(xué)的研究提供更多的材料。

圖2 基于16S rRNA基因序列的NJ分子系統(tǒng)樹Fig.2 Phylogenetic tree (NJ) based on 16S rDNA sequences

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