EPA對草魚前體脂肪細胞增殖分化的影響

劉 品 吉 紅 李 超 黃吉芹 Marijana Todor?evi?

(1.西北農林科技大學動物科技學院, 楊凌 712100; 2.挪威水產養殖、漁業與食品綜合研究所, 卑爾根 P.O.Box 5010)

高不飽和脂肪酸脂肪酸(Highly unsaturated fatty acid, HUFA)是指具有 20個以上碳原子, 并含有兩個或兩個以上不飽和鍵的脂肪酸, 主要包括二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)。諸多學者采用離體細胞培養體系進行研究發現, HUFA可影響哺乳動物脂肪細胞發育[1—4]。李惠俠等[3]指出 DHA可抑制大鼠前體脂肪細胞的增殖和分化, 并下調脂肪特異性分化轉錄因子—過氧化物酶體增殖激活受體 γ(Peroxisome proliferator activiated receptor γ,PPARγ)mRNA的表達量。Kim,et al.[4]也發現DHA可抑制3T3-L1脂肪細胞分化, 促進脂肪細胞水解, 并誘導細胞凋亡。

盡管HUFA并非草魚的必需脂肪酸, 但已有研究證實其對草魚的脂質代謝有著顯著的影響, 且該方面的研究多采用在體的方式[5—9]。如吉紅等[8,9]用富含 EPA和 DHA的日糧飼喂草魚, 發現其可抑制草魚脂質合成并減少脂質向肝臟組織的轉運, 最終降低肝胰臟脂肪及腹腔脂肪的沉積。近年來, 隨著魚類脂肪細胞培養體系的建立[10—13], 采用離體模型進行脂質代謝的研究也逐漸增多[14—17]。Todor?evi?,et al.[14]用不同脂肪酸處理大西洋鮭前體脂肪細胞發現, EPA可顯著降低脂肪細胞蓄積甘油三酯的能力。而EPA對草魚脂肪細胞影響的研究尚未見報道。

為了深入探究HUFA對草魚脂質代謝的影響及其機理, 在本實驗室已建立的草魚脂肪細胞培養體系基礎上, 研究了EPA對體外培養的草魚脂肪細胞增殖分化及相關基因表達的影響, 以期為草魚HUFA營養機理研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物 體重1 kg左右健康草魚, 購于楊凌康樂市場。

主要試劑 DMEM/F12固體培養基(Gibco),胎牛血清(四季青)、Ι型膠原酶(Gibco) 、牛血清白蛋白(Gibco)、無脂肪酸牛血清白蛋白(北京經科宏達生物技術有限公司)、牛胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉、氫化可的松、油紅O、MTT、EPA均購自Sigma公司, 碳酸氫鈉、無水乙醇等化學試劑均為國產分析純。反轉錄試劑盒及熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

草魚前體脂肪細胞獲得及培養 試驗魚在水族箱中停食暫養1d左右。試驗前將魚敲暈后剪斷鰓弓放血, 清洗干凈并用75%酒精擦拭魚體進行消毒,無菌環境中解剖取出腹腔腸系膜脂肪組織, 將其放入含 5%牛血清白蛋白的 PBS緩沖液中, 并稱量記錄分離的脂肪組織總重量。

將取出的脂肪組織用PBS沖洗3次后放入燒杯,加入等體積的0.1% Ι型膠原酶消化液, 剪碎組織的同時對組織進行消化, 15min后用含有20%胎牛血清的培養液終止消化反應。隨后將混合液放于50 mL離心管, 800 g離心10min, 棄上層液體, 用不含胎牛血清的DMEM/F12培養基將沉淀的細胞重懸, 吹打均勻, 將細胞懸浮液通過 200目的尼龍網過濾, 收集濾液, 800 g離心10min, 棄上層液體, 加入20 mL紅細胞裂解液, 靜置5min, 800 g離心5min, 棄去上清。將獲得的草魚前體脂肪細胞用不含血清的培養液重懸清洗, 800 g離心5min, 重復兩次后用含20%胎牛血清的基礎培養基將細胞重懸, 以10 g/25 cm2密度接種于預先用 1%明膠涂布板底的培養板內,于28℃, 5% CO2條件下進行培養, 隔天換液并觀察細胞增殖發育情況。當細胞生長至匯合階段(接種6d), 給細胞換誘導培養基繼續培養, 具體流程(圖1)。

MTT法檢測草魚前體脂肪細胞增殖 按照前述方法獲得草魚前體脂肪細胞并培養, 待細胞貼壁后, 分別用加有0、50、100 μmol/L EPA的基礎培養基進行處理, 處理1、2、3和4后通過MTT比色測定草魚前體脂肪細胞增殖活性。每孔加入 20 μL新鮮配制的MTT溶液, 28℃繼續培養4h后終止培養,棄去孔內培養液, 每孔加 150 μL DMSO, 震蕩10min。波長490 nm處, 以經過相同處理的無細胞孔作為空白進行調零, 在全波長酶標儀(Gene, USA)上測定各孔OD值。

油紅O染色提取法檢測草魚前體脂肪細胞分化按照前述方法培養細胞, 待細胞增殖達到80%以上匯合后, 將基礎培養基換為誘導培養基, 并在誘導培養基中分別加入0、50、100 μmol/L EPA, 分別取誘導分化1、3和5d的細胞, 各孔細胞用PBS洗3次, 10%甲醛溶液固定30min后, 用PBS洗2次, 紅油O染色液浸染10min, PBS洗2次, 異丙醇分色20s,倒置顯微鏡下觀察細胞內脂滴染色情況并拍照。隨后每孔加入1 mL異丙醇, 恒溫搖床內震蕩10min以萃取被染細胞中的油紅 O, 以相同處理的無細胞孔作為空白調零, 紫外分光光度計(島津UVmini 1240,Japan)500 nm波長處比色, 記錄OD值。

Real-time qPCR檢測基因表達情況 當細胞增殖到80%匯合時(接種6d)分別用0、100 μmol/L EPA處理。2d后吸棄培養液, 室溫下PBS洗滌2—3次, 提取RNA, 取1 μg總RNA進行反轉錄, 方法參照 TakaRa公司的 PrimeScript?RT reagent Kit (Perfect Real Time)說明書。實時定量檢測采用CFX-96實時定量 PCR檢測系統(Bio-Rad, USA)進行, 反應體系為 20 μL, 包括： 10 mmol/μL 的上下游引物各 0.6 μL、1 μL cDNA、10 μL 2×SYBR?Premix ExTaq? II S、7.8 μL 滅菌水。反應條件為： 95℃, 10s; 95℃, 15s; 57℃,15s; 40個循環。根據擴增曲線得到的Ct值(熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數), 計算出目標基因與內參基因β-actinCt值的差異ΔCt, 計算出不同樣品相對于內參基因表達倍數 2?ΔCt, 從而制作相對定量的圖表。基因檢測實時定量引物(表1)。

圖1 草魚前體脂肪細胞體外培養模式圖Fig.1 Summary of grass carp preadipocytes development

表1 實時定量檢測引物列表Tab.1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.3 數據分析

所得數據用平均值±標準差(Mean±SD)表示。采用 SPSS13.0軟件中單因素方差分析(One-way ANOVA)和t檢驗對所得數據進行顯著性檢驗分析,當P<0.05時, 認為差異顯著。

2 結果

2.1 草魚前體脂肪細胞發育過程

草魚前體脂肪細胞接種第1天(圖2A), 隔天換液, 培養第 4天可見貼壁細胞伸展呈梭形, 并開始形成草魚前體脂肪細胞增殖群落(圖2B), 接種6d后,前體脂肪細胞大量增殖, 可覆蓋培養皿底面積 80%(圖 2C), 此時換成誘導培養液繼續培養。接種 14d(誘導培養 8d)部分細胞分化完全, 胞內形成若干大脂滴(圖 2D)。

2.2 EPA對草魚前體脂肪細胞增殖的影響

從表2中可以看出, 50 μmol/L EPA處理脂肪細胞2d內可顯著促進細胞的增殖(P<0.05), 但是從3d起其促進作用消失(P>0.05), 到第4天轉為抑制作用(P<0.05); 100 μmol/L EPA組在前3天始終對草魚前體脂肪細胞的增殖起到顯著的促進作用(P<0.05),到第4天促進作用消失(P>0.05)。

2.3 EPA對草魚前體脂肪細胞分化的影響

EPA對草魚前體脂肪細胞脂質蓄積能力的影響在草魚前體脂肪細胞分化第 1天, 分別用含 50 μmol/L和100 μmol/L EPA的培養液孵育處理細胞1d后, 通過油紅O脂滴特異染色后發現, 細胞內被油紅O染成亮紅色的脂滴數與充脂細胞數減小較對照組減少(圖 3)。油紅 O染色提取法比色法(以 OD值表示)定量分析細胞內脂質的生成量, 結果表明,EPA處理 1d可顯著降低細胞內的脂質生成量(P<0.05, 圖 4)。但是隨著處理時間的延長, EPA對草魚前體脂肪細胞分化的抑制效果逐漸減弱, 處理組脂滴數量與大小逐漸趕上對照組。并且, 處理組脂質含量測定結果也與對照組相近(P>0.05)(圖4)。

EPA對草魚前體脂肪細胞分化初期脂代謝相關基因表達的影響 如圖5所示, 100 μmol/L EPA處理脂肪細胞2d后, 顯著促進了細胞LPL和PGC-1α基因的表達(P<0.05), 而對PPARs家族基因的表達無顯著性影響(P>0.05, 圖5)。

3 討論

脂肪組織發育的實質是脂肪細胞數目的增加和體積的增大, 而脂肪細胞由不含大脂滴的前體脂肪細胞發育為儲存脂質的成熟脂肪細胞受到許多因子調控。EPA和 DHA是魚油中最主要的多不飽和脂肪酸, 它們均具有抑制動物體甘油三酯合成的作用。研究表明, EPA可改善肥胖及肥胖相關的疾病如胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病和心血管疾病, 提高脂肪組織、肝臟和肌肉組織的胰島素敏感性, 并促進葡萄糖利用[18,19]; DHA可劑量和時間依賴性地降低3T3-L1前體脂肪細胞和原代培養的大鼠前體脂肪細胞的增殖活力[1,2]。本研究則首次探討了 EPA在離體條件下對草魚脂肪細胞發育的影響, 發現 EPA處理前2d可顯著促進細胞增殖, 但是到增殖的第4天 50 μmol/L處理組呈現出顯著抑制作用, 這一現象與DHA在3T3-L1及大鼠上的作用存在差異, 表明不同種類脂肪酸對于脂肪細胞增殖的影響可能存在不同的調節機制。相關研究尚需進一步進行。

表2 MTT檢測EPA對草魚前體脂肪細胞增殖的影響Tab.2 Effects of EPA on preadipocytes proliferation of grass carp by MTT assay

前體脂肪細胞分化是甘油三酯沉積的過程, 涉及一系列的轉錄事件。PPARs家族的三個成員(PPARα、PPARβ、PPARγ)在脂肪細胞脂肪酸代謝中發揮著重要的作用。PPARα主要在脂肪酸的氧化代謝中發揮重要作用, 但是它在白色脂肪細胞中的表達量較低; PPARγ則在細胞的脂質生成過程中發揮關鍵的作用, 在白色脂肪細胞中得表達量較高; PPARβ在脂肪組織代謝和能量的動態平衡發揮著重要作用[20]。Chambrier,et al.[21]在人的脂肪細胞上研究發現EPA可顯著促進PPARγ表達, 但Yoshiyuki,et al.[22]對 3T3-L1的研究發現了相反的結果,且沒有對分化造成影響。Manickam,et al.[23]則指出EPA可顯著降低脂肪細胞脂滴的大小以及脂質含量。在本研究中, EPA沒有影響PPARs家族3個成員的表達, 但卻在分化初期顯著抑制了草魚脂肪細胞蓄積甘油三酯的能力(圖 4), 與 Manickam,et al.[23]在 3T3-L1上的研究結果一致。

另一方面, 本研究發現 EPA顯著促進了脂質分解基因LPL和線粒體生成相關基因PGC-1α的表達(圖5)。LPL是脂肪細胞平衡脂質生成與分解的限制酶[24]。Todor?evi?,et al.[25]研究發現LPL在大西洋鮭前體脂肪細胞發育過程中相對于接種第 1天呈現先升高后降低最后又升高的波動趨勢, 在細胞增殖過程中LPL表達升高, 細胞匯合后至細胞分化中期LPL表達降低, 細胞分化后期LPL表達升高。在本試驗中,在草魚前體脂肪細胞分化初期, EPA促進了LPL的表達, 表明EPA可能通過LPL促進了細胞的脂質分解從而降低了細胞脂質的蓄積能力。Manickam,et al.[23]的研究表明EPA可上調3T3-L1脂肪細胞LPL和HSL等基因的表達, 并抑制脂肪細胞的分化。Mak-Soon,et al.[26]則發現EPA可通過上調脂質分解基因和下調脂質合成基因促進 3T3-L1脂肪細胞的脂質分解。另一方面, 也有研究表明攝入魚油可促進人和小鼠脂肪組織LPL基因的表達[27,28], 本研究結果與之一致。以上結果表明, EPA有可能通過促進脂肪細胞的脂質分解進而抑制脂肪細胞的脂質蓄積。

PGC-1α參與調控線粒體的生成[29]、適應性產熱、線粒體生成、肝臟脂肪酸β氧化、脂肪細胞分化等多種代謝過程[30], 在調節能量代謝中發揮著重要的作用。PGC-1α在有高能量需求及線粒體豐富的組織中表達水平相對較高, 而在白色脂肪細胞表達極少[31]。Lu,et al.[32]研究發現PGC-1α在豬的前體氧化代謝基因核呼吸因子(Nuclear respiratory factor-1,Nrf-1)的表達。本實驗室曾報道飼喂HUFA可顯著促進草魚肝臟PGC-1α基因的表達[34], 且肝臟脂質含量也顯著下降。有學者在人的脂肪細胞中超表達PGC-1α, 結果致使脂肪細胞儲能作用變成能量耗散作用[35]。在本實驗中 EPA促進了脂肪細胞PGC-1α基因的表達, 同時發現 EPA處理組細胞的脂質含量顯著低于對照組, 推測PGC-1α的表達升高促進了細胞線粒體的增殖發育, 進而促進細胞對脂肪酸的氧化分解, 最終通過抑制脂肪細胞脂質生成降低脂質蓄積。

圖2 草魚前體脂肪細胞發育過程圖Fig.2 Morphology of grass carp preadipocytes development

圖3 EPA對草魚脂肪細胞分化過程中形態的影響Fig.3 Morphological changes of grass carp adipocytes treated with EPA

圖4 EPA對草魚前體脂肪細胞分化的影響Fig.4 Effects of EPA on differentiation of grass carp preadipocytes by Oil Red O extraction

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