飼料蛋白水平對低溫應激下吉富羅非魚血清生化指標和HSP70 mRNA表達的影響

強 俊 楊 弘 王 輝 徐 跑 何 杰

(1.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心, 農業部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室, 無錫 214081;2.南京農業大學無錫漁業學院, 無錫 214081; 3.廣東海洋大學水產學院, 湛江 524025)

在集約化養殖中, 魚類經常會應對各種脅迫。脅迫可引發魚體在短期內機體平衡調節[1], 從而導致生理上的變化。這些生理響應可以通過腎上腺素調節機制達到增加能量利用、釋放兒茶酚胺以及提高促腎上腺皮質激素和血漿皮質醇水平[2]。應激時間延長可能導致急性應激轉為慢性脅迫, 使機體的不平衡增多[3]。

在應激期內, 魚類具有較差的抗逆性, 對病原體的易感性較高。如在低溫環境下, 屈撓細菌可引發魚類皮膚損害綜合癥[4]; 而車輪蟲病與淋巴囊炎病毒可能在低溫下引發魚類的白點病[5]。2010年全球羅非魚產量達到 300萬噸, 中國羅非魚產量占全球產量的一半。羅非魚已成為中國南方地區主要養殖的淡水品種之一。然而, 隨著全球氣候日益惡化與反常, 夏天溫度過高以及冬天溫度過低等, 這對羅非魚的可持續發展產生了嚴重影響。低溫應激可引發羅非魚肝臟損傷[6]、機體免疫功能下降, 同時,增加海豚鏈球菌的致病性[3]。

魚類的最優生長狀態依賴于飼料的營養狀況,以及魚類的生理狀態、年齡、繁殖性能以及一些環境因子(如： 溫度、鹽度等)[7]。魚類在應激時的生理變化往往與營養狀況緊密相關。Atwood,et al.[8]研究發現, 在飼料中添加椰油后, 尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)的低溫應激能力明顯高于添加鯡魚油的實驗組。Abdel-Tawwab & Mousa[9]研究發現,飼料中較高的蛋白水平可明顯提高尼羅羅非魚在擁擠脅迫下的應激能力。Kiron,et al.[10]研究發現, 最優蛋白水平下虹鱒(Oncorhynchus mykiss)抗病毒感染能力明顯高于低蛋白或高蛋白時的。羅非魚屬亞熱帶魚類, 能夠在 6—10℃的低溫水環境下短時間存活, 低溫耐受性較差[11]。因而, 研究飼料蛋白水平與低溫脅迫的關系具有重要意義, 有助于預測魚類生理需求方面可能的變化, 以及飼料蛋白水平是否可以改變魚體的抗應激能力, 降低脅迫對魚體的影響。本研究選取在3種蛋白水平下(25%、38%和50%)飼養的羅非魚, 采用急性低溫應激, 分析應激后羅非魚的生理生化響應, 旨在為吉富羅非魚的高效健康養殖提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

尼羅羅非魚幼魚來自中國水產科學研究院淡水漁業研究中心宜興基地自繁的第 16代“吉富”品系,選擇無病無傷, 活力強的個體作為實驗用魚。實驗前在室內水泥池(水溫27 ℃ ± 0.3 ℃ , pH 7.4±0.2)中暫養10d, 水體循環使用, 連續充氣, 自然光周期。每天 7：00、11：00和 16：00各投喂沉水性飼料1次(粗蛋白質為 38.0%、脂肪 8.0%), 投喂量為體重的10%—12%。

1.2 實驗方法

設置3組不同飼料蛋白水平, 分別為25%、38%和50%, 每組設3個平行, 飼料成分(表1)。實驗在封閉式水循環養殖系統中進行, 實驗用魚平均體重為 27.64 (±2.79) g, 體長為 9.43 (±0.46) cm, 每個養殖桶放置30尾魚。實驗共使用9個450 L的養殖桶,每個蛋白水平設置3組平行。每日投喂3次(7：00、12：00和 17：00), 日投喂量為魚體總重量的 5%—10%。每隔10天測定魚的生長情況, 調節投喂量, 養殖周期為 8周, 養殖條件： 水溫 27(±0.3)℃ , pH 7.5±0.2, 溶氧在5.0 mg/L以上, 氨氮和亞硝酸鹽分別不高于0.01 mg/L, 自然光周期, 每天換水1/3。

飼養結束后, 禁食 24h, 選擇規格基本一致的魚進行低溫應激實驗。從水溫為27℃的桶中選取20尾轉入水溫為14℃(水溫低于14℃時, 吉富羅非魚停止攝食并開始出現死亡現象)的相應9個450 L養殖桶中, 進行 24h急性低溫應激, 用自動控溫系統控溫于14℃, 保證溶氧充足, 實驗期間不投餌, 盡量減少人為干擾。

表1 飼料組分與組成Tab.1 Ingredients and composition of experimental diets

1.3 采樣與制備

分別于0、6、12和24h進行采樣。每個養殖桶隨機選取3尾魚, 用200 mg/L的MS-222作快速深度麻醉, 尾靜脈采血, 血樣于4℃冰箱中靜置2h, 在4 ℃ , 3500 r/min 離心10min制備血清, 上清液移置?80℃冰箱中保存備用, 并取約0.1 g的肝臟組織用液氮速凍后, 于?80℃保存備用。

1.4 測定指標與方法

血清生化指標的測定 皮質醇采用羅氏電化學發光免疫分析儀E170測定, 試劑盒購自北京北方生物技術研究所; 總蛋白、白蛋白、球蛋白、葡萄糖、甘油三脂、膽固醇、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和堿性磷酸酶用羅氏全自動生化分析儀測定, 試劑盒均購自上海駿實生物科技有限公司; 溶菌酶活力的測定采用南京建成生物科技有限公司的試劑盒。

肝臟HSP70 mRNA表達的測定 根據Genbank中羅非魚 HSP70序列(FJ207463.1), 設計HSP70引物, F1： CATCGCCTACGGTCTGGACAA,R1： TGCCGTCTTCAATGGTCAGGAT。用羅非魚的管家基因β-actin (EU887951.1)作為內參, 設計β-actin引物, F1： CCACACAGTGCCCATCTACGA,R1： CCACGCTCTGTCAGGATCTTCA。所有引物由上海基康生物技術有限公司合成, 擴增的片段為100—110 bp, 取羅非魚肝臟20 mg左右, 參照RNeasy Mini Handbook (QIAGEN 公司)說明書用試劑盒提取總RNA,A260/A280為1.90左右。

根據PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time(大連 TaKaRa公司)進行 RT反應, 然后采用ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System的SYBR Green滲入法進行實時定量 PCR擴增反應, 以β-actin為內參。PCR反應體系(50 μL)包括： 高壓滅菌去離子水 19 μL、SYBR Green PCR Master Mix(2×)25 μL、正向及反向引物(10 μmol/L)各 2 μL、cDNA工作液4 μL。反應條件為： 95 ℃ 5 min,然后40個循環(95 ℃ 1 5s, 60 ℃ 6 0s,讀板記錄熒光量), 反應結束后制備溶解曲線, 反應條件為： 95 ℃ 15s,60 ℃ 1 5s, 95 ℃ 1 5s。每個反應設3復孔。所有檢測樣品均包含1個無模板的陰性對照以排除假陽性結果。

1.5 數據處理

在HSP70與β-actin的定量PCR擴增效率基本一致的前提下, 計算HSP70 mRNA表達量。以羅非魚β-actin為內參, 對得到的各樣品Ct值進行均一化處理, 以25%蛋白水平組0h時的HSP70 mRNA表達量為基準, 應用 2?ΔΔCt法[12]確定不同時間點各處理組 mRNA的相對表達量。數據結果用平均值±標準差(Mean±SD)表示, 實驗數據用 SPSS15.0統計軟件進行方差分析。

2 結果

2.1 低溫應激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清皮質醇和葡萄糖水平的影響

飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚在低溫應激試驗期間, 未發現死魚。由圖1A可以發現, 低溫應激對羅非魚血清皮質醇水平有明顯影響。應激 6h時,各蛋白水平組呈上升趨勢。應激 24h時, 各實驗組血清皮質醇水平分別為557.4、709.5和453.7 ng/mL,均顯著低于應激6h的水平, 但仍顯著高于應激前的水平(P<0.05)。38%蛋白組的皮質醇水平在應激24h后高于其他實驗組(P<0.05)。

低溫應激對羅非魚的血清葡萄糖水平產生了一定的影響(圖1B)。當溫度從27℃突降到14℃時, 25%和 38%蛋白組的葡萄糖水平在應激 6h時表現出上升趨勢, 開始較為緩慢, 24h時急劇上升, 分別達到6.05和 4.99 mmol/L(P<0.05); 50%蛋白組的葡萄糖水平呈先下降后上升的變化趨勢, 應激 24h時, 葡萄糖水平與應激前相比無顯著差異(P>0.05)。

2.2 低溫應激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清總蛋白、白蛋白和球蛋白水平的影響

在低溫應激下, 25%蛋白組的血清總蛋白水平在應激24h內呈上升趨勢; 38%和50%蛋白組的總蛋白水平呈先上升后下降的變化趨勢(圖2A)。24h時,各實驗組的血清總蛋白水平與應激前相比無顯著差異(P>0.05)。

圖1 不同蛋白水平對吉富羅非魚幼魚在低溫應激下血清皮質醇(A)和葡萄糖(B)水平的影響Fig.1 Effects of different dietary protein levels on serum cortisol (A) and glucose (B) levels of GIFT tilapia under low temperature stress

血清白蛋白的變化趨勢與總蛋白相似(圖2B)。38%和50%蛋白組的血清白蛋白水平在應激6h時達到峰值, 隨后呈逐漸下降趨勢。24h時, 各實驗組的血清白蛋白水平與應激前相比無顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同蛋白水平對吉富羅非魚幼魚在低溫應激下血清總蛋白(A)、白蛋白(B)和球蛋白(C)水平的影響Fig.2 Effects of different dietary protein levels on serum total protein (A), albumin(B) and globulin(C) levels of GIFT tilapia under low temperature stress

隨著應激時間的延長, 各實驗組球蛋白水平均呈先上升后下降的變化趨勢(圖2C)。應激24h時, 除38%蛋白組的血清球蛋白水平顯著高于應激前外(P<0.05), 其他各實驗組與應激前相比無顯著差異(P>0.05)。

38%和50%蛋白組的血清白蛋白/球蛋白比值隨著應激時間的延長呈下降趨勢(表 2), 應激 24h時,顯著低于應激前的水平(P<0.05); 25%蛋白組的比值與應激前相比無顯著差異(P>0.05)。

表2 不同蛋白水平對吉富羅非魚幼魚在低溫應激下血清白蛋白/球蛋白比值的影響Tab.2 The variation of albumin/globulin ratio of GIFT tilapia under low temperature stress during 24h

2.3 低溫應激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和堿性磷酸酶活力的影響

應激前, 不同蛋白水平下各實驗組血清谷丙轉氨酶活力有顯著差異(圖 3A), 50%蛋白組血清谷丙轉氨酶活力為8.0 U/L顯著高于25%蛋白組的4.67 U/L。各實驗組血清谷丙轉氨酶活力在應激24h內呈逐漸上升趨勢, 25%蛋白組血清谷丙轉氨酶活力在應激24h時顯著高于38%和50%蛋白組(P<0.05)。

應激前, 50%蛋白組的血清谷草轉氨酶活力顯著高于25%和38%蛋白組(圖3B)。低溫應激后, 各實驗組的谷草轉氨酶活力開始顯著上升。24h時,25%和50%蛋白組血清谷草轉氨酶活力低于12h時的活力, 而 38%蛋白組的谷草轉氨酶活力與 12h時相比無顯著差異(P>0.05)。

各實驗組堿性磷酸酶活力的變化趨勢與谷草轉氨酶活力的基本相同(圖3C)。應激24h時, 38%蛋白組血清堿性磷酸酶活力顯著高于應激前的水平(P<0.05), 而 25%和 50%蛋白組堿性磷酸酶活力與應激前相比無顯著差異(P>0.05)。

2.4 低溫應激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清甘油三酯和膽固醇水平的影響

在應激前, 隨著飼料蛋白水平上升, 血清甘油三酯水平顯著提高(P<0.05)(圖 4A)。在低溫應激后,各實驗組基本呈先下降會上升的變化趨勢。應激6h時, 各實驗組血清甘油三酯水平顯著下降(P<0.05);應激24h時, 50%蛋白組血清甘油三酯水平與應激前相比無顯著差異(P>0.05)。

在應激前, 50%蛋白組的血清膽固醇水平顯著高于 25%和 38%蛋白組(圖 4B)。在應激后, 25%和38%蛋白組血清膽固醇水平呈先上升后下降的變化趨勢, 24h時, 兩實驗組與應激前相比無顯著差異(P>0.05); 50%蛋白組血清膽固醇水平隨應激時間的延長呈下降趨勢。

圖3 不同蛋白水平對吉富羅非魚幼魚在低溫應激下血清谷丙轉氨酶(A)、谷草轉氨酶(B)和堿性磷酸酶(C)活力的影響Fig.3 Effects of different dietary protein levels on serum glutamic-pyruvic transaminase (A), glutamic-oxaloacetic transaminase(B) and Alkaline phosphatase (C) activities and of GIFT tilapia under low temperature stress

2.5 低溫應激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清溶菌酶活力的影響

低溫應激對于血清溶菌酶活力有顯著影響(圖5A)。各實驗組血清溶菌酶活力在應激前無顯著差異(P>0.05)。低溫應激后, 溶菌酶活力顯著升高; 12h和24h時, 各實驗組溶菌酶活力低于6h時的, 但均顯著高于應激前水平(P<0.05)。

2.6 低溫應激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚肝臟HSP70 mRNA表達的影響

低溫應激對羅非魚肝臟HSP70 mRNA的表達水平有顯著影響(P<0.05)。隨著應激時間的延長, 各實驗組呈先上升后下降的變化趨勢(圖5B)。應激12h時, 38%和50%蛋白組肝臟HSP70 mRNA的相對表達量顯著高于25%蛋白組(P<0.05); 24h時, 各蛋白組均呈下降趨勢。

3 討論

水溫是魚類工廠化養殖中的重要影響因素之一。在實際生產中, 可能因為季節的變化或其他人為因素的影響, 魚類經常會面對低溫所產生的脅迫。低溫環境會降低魚類的攝食率, 導致魚體生長速度下降, 同時也會誘使魚類產生生理生化上的改變, 增加病害發生的幾率[3,13]。應激反應是機體對外界刺激的一種非特異性防御反應, 主要是交感神經興奮和垂體-腎上腺皮質分泌增多引起的一系列神經內分泌反應[1]。

3.1 低溫應激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清皮質醇和葡萄糖水平的影響

急性或慢性應激可以顯著影響魚類的血清生化參數。皮質醇是一種與許多生物活性相關聯的類固醇激素。通常, 在低溫應激下魚類血清皮質醇水平開始呈上升趨勢, 隨著時間的延長而逐漸下降, 顯示了魚體對新環境的適應[14]。血清皮質醇水平被廣泛用作應激狀況下的觀察指標[15]。在本實驗中, 低溫應激 6h后, 各應激組血清皮質醇水平顯著升高,這與Sun,et al.[16]和劉波等[6]的研究結果相似。Su,et al.[16]研究發現, 在14℃低溫應激下, 尼羅羅非魚血清皮質醇水平顯著升高; 劉波等[6]也研究發現, 將正常飼養條件下(25)℃的吉富羅非魚進行冷應激處理(9), ℃血清皮質醇水平顯著升高。在其他魚類,如大西洋鱈魚(Gadus morhua)[17]、雜交條紋鱸(Morone chrysops×Morone saxatilis)[18]和 鱘 魚(Acipenser medirostris)[19]的研究中也得到類似結論。在應激 24h時, 各實驗組血清皮質醇水平呈下降趨勢, 但仍顯著高于應激前。可能是因為, 在低溫應激24h后, 吉富羅非魚的耐受性有所增強, 然而仍未適應環境溫度。50%蛋白組血清皮質醇水平在應激24h后低于 25%和 38%蛋白組, 短期投喂較高蛋白水平的飼料可能有助于緩解羅非魚在低溫應激下的脅迫響應。

圖4 不同蛋白水平對吉富羅非魚幼魚在低溫應激下血清甘油三酯(A)與膽固醇(B)水平的影響Fig.4 Effects of different dietary protein leveld on serum triglyceride (A) and cholesterol (B) levels of GIFT tilapia under low temperature stress

圖5 不同蛋白水平對吉富羅非魚幼魚在低溫應激下血清溶菌酶活力(A)和肝臟HSP70 mRNA (B)表達的影響Fig.5 Effects of different dietary protein levels on serum lysozyme activity (A) and relative expression of liver HSP70 mRNA (B) of GIFT tilapia under low temperature stress

血清葡萄糖主要來自食物中消化吸收后的葡萄糖及肝糖原的分解和異生作用[20]。在投喂不同蛋白的飼料后, 羅非魚血清葡萄糖水平隨飼料蛋白水平的減少而下降, 這與Abdel-Tawwab,et al.[21]對羅非魚的研究結果相似。面對應激時, 機體組織利用血糖作為主要能量來源, 腎上腺素的分泌導致血糖增加。在本實驗中, 低溫應激后, 25%和38%蛋白組的血清葡萄糖水平顯著上升。在應激條件下可以刺激某些葡萄糖轉運基因的表達, 增加葡萄糖在細胞間的轉運[22]。同時, 血清中皮質醇水平的變化也能對葡萄糖代謝產生影響。Vijayan & Moon[23]研究發現,皮質醇是一種重要的皮質類固醇激素, 皮質類固醇的增加使機體各組織對葡萄糖的利用率降低, 肝臟糖異生作用加強, 結果導致血糖升高, 為機體應對環境提供能量。Sun,et al.[16]也研究發現, 在低溫應激下可以顯著提高尼羅羅非魚血清皮質醇與葡萄糖水平。本實驗同時發現, 50%蛋白組的血清葡萄糖水平呈先下降后上升的變化趨勢。短期投喂高蛋白的飼料會提高羅非魚血清中葡萄糖的水平。應激前期,可以利用葡萄糖分解來提供能量, 隨著應激時間的延長, 機體通過增加組織中糖原的分解或肝臟中糖原代謝的關鍵酶葡萄糖激酶活性從而提高血清葡萄糖水平[24]。

3.2 低溫應激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清總蛋白、白蛋白和球蛋白水平的影響

血清總蛋白、白蛋白與球蛋白水平的變化可以作為魚體應對外界應激的重要指標[25]。血清總蛋白反映魚體的營養和代謝狀況, 白蛋白在魚體內起到營養細胞和維持血液滲透壓的作用, 而球蛋白與機體的免疫功能相關。在本實驗中, 50%蛋白組中血清總蛋白水平在應激前高于25%和38%蛋白組。飼料中粗蛋白水平的提高, 可以增加消化蛋白的含量或飼料中過量的蛋白被消化道吸收后, 在血液中沉積[26]。在低溫應激后, 38%和50%蛋白組血清總蛋白水平均呈先上升后下降的變化趨勢。可能因為低溫應激使羅非魚肝臟受損, 短期內提高了機體的非特異性免疫水平, 隨著應激時間延長, 機體合成的能量更多用于應對環境脅迫, 用于魚體蛋白質合成則減少, 因而, 引起血清總蛋白水平降低。25%蛋白組血清總蛋白水平在應激后24h內始終是上升趨勢。投喂低蛋白水平的飼料可能會引起魚體營養不良,造成免疫功能下降[27]。蔡春芳等[27]研究發現, 投喂20%蛋白組的異育銀鯽(Carassius auratus)其機體免疫力高于10%蛋白組。因而, 在應激時, 魚體需要不斷地分解組織中儲存的能量來滿足生理需要。

血清白蛋白水平和白蛋白/球蛋白比值可以衡量機體正常的蛋白質維持程度[28]。本實驗發現, 38%和50%蛋白組血清白蛋白與球蛋白水平隨著應激時間延長呈先上升后下降的變化趨勢。這可能與短期應激可以提高羅非魚的能量代謝與免疫功能有關。25%蛋白組血清白蛋白與球蛋白水平基本處于上升趨勢, 魚體可能需要分解更多的能源物質來提供能量。Adham,et al.[28]也認為, 血清總蛋白、白蛋白等濃度的變化可作為魚類環境響應的指標。不同魚類血清蛋白的變化有較大差異, Collazos,et al.[29]發現丁鯛(Tincatinca)血清白蛋白和球蛋白在冬季低溫時顯著下降; Sala-Rabanal,et al.[27]發現低溫應激下可引起海鯉(Cyprinus qionghaiensis)白蛋白等血漿蛋白質水平顯著下降; 冀德偉等[30]發現在 8.5℃低溫下, 大黃魚(Pseudosciaena crocea)血清總蛋白隨應激時間的增加呈先下降后上升的變化趨勢。在本研究中 38%和 50%蛋白組血清白蛋白/球蛋白比值顯著低于應激前。這可能與低溫應激提高了兩實驗組血清球蛋白水平有關。

3.3 低溫應激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和堿性磷酸酶活力的影響

血清谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)活力可以作為肝臟損傷的指示物。在本實驗中, 低溫應激前, 50%蛋白組血清ALT 和AST活力高于38%和25%蛋白組, 投喂高蛋白可能會增加了肝臟的壓力。在低溫應激后, 各實驗組血清ALT和AST活力基本呈上升趨勢, 這與劉波等[6]的研究結果相似。在應激24h時, 各實驗組 ALT活力顯著高于應激前。ALT作為肝臟中連接糖、脂質和蛋白質代謝的重要酶,應激可能對肝臟組織造成了一定損傷, 導致血清ALT活力短期內升高[31]。25%蛋白組血清ALT活力顯著高于38%和50%蛋白組。這可能與短期投喂高蛋白飼料可以提高其免疫功能有關。AST屬于細胞內酶, 在正常情況下主要存在于肝細胞的可溶性部分, 在血清中水平較低。在應激條件下可以提高肝細胞的產酶活性或增加細胞膜通透性與細胞壞死,AST大量進入血液, 使血清中酶活性提高[32]。本實驗表明, 50%蛋白組血清AST活力在應激24h后顯著低于38%和25%蛋白組。短期投喂較高蛋白水平的飼料可能有助于提高魚體在低溫環境下的自我保護能力, 降低細胞膜的通透性, 阻抑細胞內ALT的溢出。

堿性磷酸酶(AKP)屬于代謝調控酶, 與磷酸基團轉移和鈣磷代謝有關[33]。在本實驗中, 在應激24h內, 25%和50%蛋白組血清AKP活力呈先上升后下降的變化。在低溫應激下, 羅非魚可以增加糖類和脂質代謝, AKP與腸內脂質轉移有關, 短期應激可以促進血清中AKP活力增加。然而, 隨著應激時間的延長, 血清中高濃度的皮質醇會促使脂肪降解,抑制AKP活性, 降低機體免疫力。38%蛋白組血清AKP活力在應激期間始終處于上升趨勢, 應激 24h時顯著高于25%和50%蛋白組。當飼料蛋白水平過量或低于適宜范圍時, 可能會對魚體產生分解或應激壓力, 增加肝臟與腎臟的負擔, 降低魚體的免疫應激能力。

3.4 低溫應激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清甘油三酯和膽固醇水平的影響

魚類對應激的適應能力是由遺傳因素決定的。同時, 飼料的來源與利用、個體的發育階段等對其應激反應也有一定的影響[14]。血液中甘油三酯和膽固醇水平的變化與魚類對于脅迫后的抗應激能力有關。甘油三酯和膽固醇主要來源于腸道對于脂類的吸收以及肝臟脂肪的代謝[34]。在本實驗中, 低溫應激 24h內, 各實驗組血清甘油三酯水平基本呈先下降后上升的變化。可能是由于短暫刺激下, 魚類為了保持機體的生理生化平衡, 通過分解血清甘油三酯而提供能量。應激24h后, 50%蛋白組血清甘油三酯水平與應激前相比無顯著差異; 而 25%和 38%蛋白組血清甘油三酯水平顯著低于應激前。短期投喂高蛋白的飼料可以提高羅非魚血清甘油三酯水平,同時也可以增加組織的攝取與轉化。當血清甘油三酯水平降低時, 促使了儲存組織中的能源物質分解或轉化。50%蛋白組血清膽固醇水平顯著下降, 可能是因為魚體增加了脂肪代謝, 提供更多能量用于滿足抗應激的需要。

3.5 低溫應激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清溶菌酶活力的影響

在短期應激下血清皮質醇水平升高有利于魚體應對環境脅迫, 但持續升高則會抑制機體的免疫功能。溶菌酶(LSZ)是水生動物血淋巴細胞酶系統中的重要組成部分, 反映了機體非特異性免疫水平的變化[35]。魚體受到急性應激時, 肝臟受損, 血清中LSZ活力會顯著上升。飼喂不同蛋白水平的飼料對羅非魚血清LSZ活力無顯著影響。在低溫應激6h時, 羅非魚血清LSZ活力顯著升高。推測羅非魚在急性低溫應激下, 血清中皮質醇濃度升高, 促進血糖的合成, 加快脂肪降解, 從而促使魚體在急性應激下獲得更多的能量用于增加血清中一些特定免疫蛋白如LSZ或補體C3、C4等的含量, 從而提高機體的免疫力[36]。然而, 隨著應激時間的延長, LSZ活力開始降低, 機體免疫力下降, 進而引起一些相關免疫指標發生改變。本實驗發現, 應激24h后, 25%蛋白組血清 LSZ活力顯著下降, 這可能與其營養狀態不良,機體的免疫應激能力較差有關。

3.6 低溫應激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚肝臟HSP70 mRNA表達的影響

生理及細胞脅迫響應代表機體維持體內平衡的兩個重要防御機制。生理響應包括下丘腦-垂體-腎間組織(Hypothalamic-pituitary-interrenal, HPI)軸所分泌的一種重要的應激激素皮質醇[37]。而細胞響應主要是脅迫過程中蛋白質與基因表達的變化, 如分子伴侶HSP70與HSP90, HSPS可以與糖皮質激素受體相互作用, 調控受體的正確折疊、激活活性與細胞轉運等[38]。在應激條件下可以激活這兩種響應,Kazumi & George[39]研究發現, 當潮間帶杜父魚(Oligocottus maculosus)體內HSP70含量較高時, 機體具有更強的抗應激能力, 適應較大范圍的溫差變化。Takle,et al.[40]也發現, 低溫應激可以提高大西洋鮭(Salmo salar)體內HSP70含量。本實驗發現, 在低溫應激 6h后, 羅非魚血清皮質醇水平與肝臟HSP70 mRNA的表達量顯著上升。HSP70 mRNA的表達量在12h時達到峰值, 同時, 38%和50%蛋白組肝臟HSP70 mRNA的表達量顯著高于25%蛋白組。可見投喂較高的飼料蛋白水平有助于提高魚體對于環境應激的耐受性。在 24h時, 各實驗組的HSP70 mRNA表達水平急劇下降。可能HSP70只在一定范圍內對細胞起保護作用, 如果應激持續時間太長,就會引起肝臟細胞膜結構和蛋白質組成的異常, 從而改變HSP70在細胞內分布, HSP70對機體的保護能力也會隨之下降。

蛋白質在飼料中所占比例較大, 同時也是飼料中非常重要的營養成分之一。本研究結果表明, 投喂高蛋白飼料可以提高吉富羅非魚血清葡萄糖、總蛋白、甘油三酯和膽固醇水平, 這些能源物質在低溫應激時為魚體提供能量需求, 在一定程度上提高羅非魚的抗應激能力。同時, 投喂高蛋白飼料可能增加肝臟分解蛋白質的負擔, 并提高飼料成本。因此, 冬季溫度較低或長途運輸中溫度降幅較大時,在投喂飼料中應提早增加飼料蛋白水平, 以便提高羅非魚的抗應激能力。

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