維生素E對青魚幼魚生長、免疫及抗氨氮脅迫能力的影響

黃 云 胡 毅 文 華 鐘 蕾 郇志利李金龍 毛小偉,4 肖調義

(1.湖南農業大學動物科學技術學院, 長沙 410128; 2.中國水產科學研究院長江水產研究所, 淡水生態與健康養殖重點開放實驗室, 武漢 430223; 3.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心, 無錫 214081;4.益陽益華水產品有限公司, 益陽 413000)

在高密度集約化養殖中, 水產養殖動物殘餌和排泄物氨化作用產生大量氨態氮, 是誘發魚病的主要環境因子。大多數硬骨魚類對氨氮毒性非常敏感[1,2]。水體中過高的氨氮濃度能干擾生物體抗氧化系統,使部分抗氧化物質含量和酶活性下降[3,4], 機體清除自由基的能力降低, 脂質過氧化產物增多, 導致機體非特異性免疫防御系統遭到破壞[5], 外源病菌的易感性增加[6—8]; 鰓、腎、肝等組織結構病變, 呼吸和排泄系統受損[9—11]。近年來, 通過營養學調控理論, 提高水產動物免疫機能, 緩解外界環境應激越來越受到關注。維生素E(VE)是Evans在19世紀20年代發現的具有α-生育酚生物活性的一類脂溶性維生素, 其第六位碳原子上羥基極易被氧化, 具有很強的還原性, 是生物體內最重要的脂溶性抗氧化劑和免疫增強劑[12]。相關研究表明, 維生素E參與水產動物的細胞免疫和體液免疫[13,14], 可提高細胞介導的免疫反應、抗體滴度和吞噬細胞指數, 促進T淋巴細胞的有絲分裂[15]; 還可有效增強水產動物抵抗亞硝酸鹽[16]、酸應激[17]和擁擠脅迫能力[18]。青魚(Mylopharyngodon piceus)是我國傳統淡水養殖魚類的四大家魚之一, 在人工養殖過程中面臨水體環境突變(以氨氮突變為主)和疾病滋生等問題。本研究通過飼料中VE的添加, 探討VE對青魚生長、免疫和抗氨氮脅迫能力的影響, 以期為 VE的營養調控青魚抵抗外界環境應激提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與馴化

實驗青魚為購自湖南水產科學研究所的同一批魚苗。實驗前暫養于室外水泥池(5.0 m×1.0 m×1.5 m)中馴化2周, 日飽食投喂商品飼料2次(8：00, 16：00),日換水量占總體積1/3。暫養期間, 水溫 (24±3), ℃pH 7.31±0.2, 溶解氧含量5.0 mg/L以上, 并用次溴酸鹽氧化法進行水體氨氮監測, 總氨氮值小于或等于0.2 mg/L, 正式試驗前停食24h。

1.2 實驗設計

參照商品飼料配方, 配制粗蛋白 36.0%和粗脂肪6.0%的基礎飼料(總能約18.0 kJ/g, 表1), 以VE醋酸酯(干粉狀, 含量 50%, 青島瑪斯特生物技術有限公司友情提供)作為 VE添加源, 在基礎飼料中分別添加 VE 0(對照組)、12.5、25、50、100 和 200 mg/kg,共配制6組實驗飼料。飼料原料經粉碎后過40目篩,微量成分采取逐級擴大法混合均勻, 采用雙螺旋壓條機擠壓出1.5 mm粒徑飼料顆粒, 于陰涼處風干后?20℃保存備用。各處理組飼料實測值分別為：14.36、25.14、37.66、62.97、113.92和 210.45 mg/kg。

挑選健康活潑、規格一致的實驗青魚于室內水族箱中投喂基礎飼料馴化, 1周后挑選規格均勻的青魚[初始質量(7.27±0.40) g]隨機分配到 18個水族箱中, 每箱放養 30尾, 每組3個重復, 日投餌量為體質量的 3%—5%, 分 2次投喂(8：00—9：00, 16：00—17：00), 分別占總量的40%和60%。日換水1次, 換水量占總體積1/3并清除箱內糞便。日充氣12h, 溶氧不低于5.0 mg/L。實驗期間平均水溫 (28±2), ℃pH 7.31±0.2, 養殖水總氨氮濃度低于 0.2 mg/L, 自然光周期, 養殖持續8周。養殖實驗結束后, 青魚饑餓 24h, 從每個水族箱中撈取青魚置于盛有少量水的桶中, 計數、稱重, 記錄生長情況。根據生長情況,選擇有代表性的3組, 未添加VE組、生長最好組和高水平VE添加組, 即對照組、62.97和210.45 mg/kg VE組, 每箱隨機撈取10尾試驗青魚, 進行24h氨氮脅迫試驗, 氨氮脅迫實驗參照胡毅等[19]方法, 為了減少捕撈應激對實驗結果的影響, 在進行麻醉前將撈取的青魚放于盛有 20 L水的水箱中靜置 60min,然后滴入丁香油溶液短暫麻醉, 進行樣品的采集工作。需進行氨氮脅迫實驗的處理組青魚, 在計數、稱重、記錄生長情況后, 隨機撈取10尾青魚放于盛有10 L水的水箱中靜置60min后, 緩慢倒入配置好的40 mg/L氨氮溶液10 L, 使水體氨氮濃度達到20 mg/L左右, 每個水族箱的氨氮脅迫起始時間控制間隔在15min左右, 以便于24h后樣品采集時脅迫時間一致。脅迫后為避免撈取應激, 直接滴入丁香油至水族箱中進行短暫麻醉取樣。期間連續充氣, 保證溶氧不低于5.0 mg/L。

表1 基礎飼料組成及營養水平Tab.1 Formulation and chemical composition of the basal diet

1.3 樣品采集、分析與計算

生長指標 實驗起始和結束時, 分別對各水族箱中青魚進行記數、稱重。

特定生長率(SGR)= [(LnWf? LnWi)/T]×100%

Wf、Wi和T分別表示平均終體重(g)、平均初體重(g)和飼養時間(d)。

飼料和組織維生素E含量 在氨氮脅迫前后,分別從每個水族箱隨機取 3尾試驗青魚, 冰盤上解剖并分離出肝臟和軸上肌, 稱取一定量肝臟或肌肉,搗碎、勻漿、離心, 制備上清液備用。肝臟、肌肉和血清中VE含量均參照南京建成VE含量測定試劑盒比色法測定。飼料中 VE含量利用高效液相層析色譜(HPLC)測定。

血清指標 在氨氮脅迫前后, 從各試驗水族箱中隨機撈取8尾試驗青魚, 放入盛有0.15 mL/L丁香油溶液中短暫麻醉, 用 1 mL無菌注射器尾靜脈采血, 置于無菌離心管中, 4℃靜置12h, 3500 r/min離心15min, 取上層血清移入離心管中放置?80℃超低溫冰箱中保存備用。

皮質醇(COR)采用上海繼錦化學科技有限公司魚ELISA試劑盒測定, 丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性采用南京建成生物科技研究所試劑盒測定。

鰓絲Na+/K+-ATP酶活力 在氨氮脅迫前后,冰浴條件下, 取試驗青魚兩側第 2鰓弓上的鰓絲,用生理鹽水潤洗, 濾紙吸干水分, 用于鰓絲 Na+/K+-ATP酶(NKA)活性測定。其測定參照胡毅等[19]的方法。NKA活性單位定義為： 以每小時每毫克組織蛋白中ATP酶分解ATP產生1 μmol無機磷的量為1個 ATP 酶活力單位 [μmol P/(mg·h)]。

1.4 統計分析

實驗結果以平均值±標準差表示, 用 SPSS17.0軟件進行單因素方差分析, 當差異顯著時(P<0.05),則采用Duncan進行多重比較; 用t檢驗檢測氨氮脅迫前后的變化。

2 結果

2.1 維生素E對青魚幼魚生長的影響

隨著飼料中VE含量的增加, 青魚幼魚SGR呈升高趨勢, 當 VE含量達到或超過 37.66 mg/kg時,其SGR均顯著高于對照組(P<0.05), 且37.66、62.97、113.92和 210.45 mg/kg VE組組間無顯著差異(圖1A)。經折線模型回歸分析表明, 青魚幼魚獲得最高SGR時飼料中VE有效含量為45.0 mg/kg (圖1B)。

圖1 維生素E對青魚幼魚生長的影響(平均數±標準差, 重復數=3)Fig.1 Effects of dietary vitamin E levels on growth of juvenile Mylopharyngodon piceus (mean ± SD, n=3)

2.2 氨氮脅迫對青魚幼魚組織中維生素 E含量的影響

肌肉、肝臟和血清中VE含量均隨著飼料中VE含量的升高而呈顯著上升趨勢(P<0.05), 且當飼料中VE含量達到或超過113.92 mg/kg時, 肌肉和肝臟中VE含量均達到飽和狀態(圖2)。

氨氮脅迫使青魚肌肉和肝臟中VE有下降趨勢,各處理組肌肉中 VE含量脅迫前后差異不顯著, 而肝臟中 VE含量在氨氮脅迫前后均差異顯著(P<0.05), 脅迫后, 210.45 mg/kg VE組肝臟VE含量仍顯著高于其他組(P<0.05)。氨氮脅迫前后對照組青魚血清VE含量無顯著變化, 但62.97和210.45 mg/kg VE組血清VE含量有升高趨勢, 僅210.45 mg/kg VE組血清VE含量脅迫前后差異顯著, 且脅迫后62.97和210.45 mg/kg VE組血清VE含量仍顯著高于對照組(P<0.05)。

圖2 維生素E對氨氮脅迫前后組織維生素E含量的影響Fig.2 Effects of dietary vitamin E on tissue vitamin E contents of juvenile Mylopharyngodon piceus befor and after ammonia-nitrite stress

2.3 氨氮脅迫對部分血清生化指標的影響

飼料VE對血清COR無顯著影響(圖3), 隨著飼料 VE含量的升高, 血清 MDA含量呈下降趨勢且210.45 mg/kg VE組MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)。血清T-SOD和CAT活性隨著飼料VE含量升高呈上升趨勢, 當VE含量超過37.66 mg/kg時, CAT活性顯著高于對照組, 而VE含量達到210.45 mg/kg時, T-SOD活性才顯著高于對照組(P<0.05)。

氨氮脅迫使血清T-SOD和CAT活性降低, COR和MDA含量升高, 其中氨氮脅迫使對照組COR和MDA含量顯著升高(P<0.05)。但飼料中VE能有效降低脅迫后血清COR和MDA升高幅度, 62.97和210.45 mg/kg VE添加組氨氮脅迫前后COR含量差異不顯著, 且脅迫后210.45 mg/kg VE組COR含量顯著低于對照組(P<0.05); 62.97和210.45 mg/kg VE組氨氮脅迫前后 MDA含量雖顯著升高, 但氨氮脅迫后, 210.45 mg/kg VE組MDA含量仍顯著低于對照組(P<0.05)。氨氮脅迫對各處理組血清CAT活性無顯著影響, 卻顯著降低了對照組 T-SOD活性(P<0.05), 但62.97和210.45 mg/kg VE組T-SOD活性氨氮脅迫前后差異不顯著, 且氨氮脅迫后, T-SOD活性仍顯著高于對照組(P<0.05)。

2.4 氨氮脅迫對鰓絲NKA活性的影響

飼料中 VE對青魚鰓絲 NKA活性無顯著影響(圖4)。在氨氮脅迫后, 對照組和62.97 mg/kg VE組NKA活性均有所下降, 而210.45 mg/kg VE組NKA活性有所上升, 僅對照組鰓絲 NKA活性脅迫前后差異顯著(P<0.05), 且脅迫后210.45 mg/kg VE組均顯著高于對照組(P<0.05)。

3 討論

飼料中 VE含量在一定范圍內可明顯改善魚類的生長性能, 缺乏或過量均會對生長產生負面效應[20—22]。本研究得到類似結果。通過折線模型分析得出, 青魚獲得最大特定生長率時VE有效含量為45.0 mg/kg, 與許氏平(Sebasres schlegeli)(VE有效需求量45 mg/kg)[21]的VE有效需求量相似。但低于大西洋鮭(Salmo salar)(VE有效需求量60 mg/kg)[23]、花鱸(Lateolabrax japonicus)(VE有效需求量 60.5 mg/kg)[24]、斑點叉尾(Ictalurus punctatus Rafinesque)(VE有效需求量100 IU/kg)[20]、鯉(Cyprinus carpio)(VE有效需求量 119 mg/kg)[22], 高于雜交條紋鱸(Morone saxatilis)(VE有效需求量28 mg/kg)[25]。不同魚類對VE的代謝率不同, 可能導致對VE需求存在差異, 此外, 還與飼料的組成、實驗魚規格、投喂次數及水平、實驗條件等多種因素有關。

圖3 維生素E對氨氮脅迫前后青魚幼魚血清生化指標的影響Fig.3 Effects of dietary vitamin E on serum biochemical indexs of juvenile Mylopharyngodon piceus before and after ammonia-nitrite stress

圖4 維生素E對氨氮脅迫前后青魚幼魚鰓絲NKA活性的影響Fig.4 Effect of dietary vitamin E on gill NKA activities of juvenile Mylopharyngodon piceus before and after ammonia-nitrite stress

組織中 VE含量與餌料中 VE的含量呈正相關性[24], 但隨攝入VE量的增加, 組織中VE的積累量將到達飽和[21,24]。在本實驗中也存在同樣的趨勢,隨著飼料中 VE含量的升高, 肌肉、肝臟和血清中VE含量呈顯著升高趨勢, 當 VE含量超過 113.92 mg/kg時, 肌肉和肝臟中VE含量變化趨于飽和。氨氮脅迫對肌肉 VE含量無顯著影響, 但使各組肝臟中 VE含量顯著降低, 且脅迫后 62.97和 210.45 mg/kg VE組血清VE含量均有不同程度的升高。有學者[25]認為, 肝臟內可能存在一個維生素E的“庫”,在調節外界環境應激上存在相關性。當魚體受到應激后, 肝臟中儲存的維生素E可能被釋放至血液中,緩解機體因應激所受氧化脅迫而導致抗氧化物質含量的下降。而氨氮脅迫使血液中VE含量升高, 可能跟脅迫后機體動用肝臟中儲存的VE有關。然而, 中華鱉(Pelodiscus sinensis)[17]的研究發現, 在酸應激后, 中華鱉肝臟中VE并無顯著變化, 其原因可能與應激的類型、強度和應激時間的長短等因素有關。

動物體內參與清除體內過多自由基的防御系統包括非酶系統和酶系統。非酶系統主要包括 VE、VC、谷胱甘肽及微量元素等; 酶系統主要包括SOD(清除超氧陰離子)、CAT(清除過氧化氫)等。VE作為細胞內抗氧化劑, 可穩定多不飽和脂肪酸及脂肪合成與分解的中間產物不被氧化破壞, 還可影響花生四烯酸的代謝和前列腺素的功能[26]。在甲殼類動物如中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis Milne-Edwards)[26]、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[27], 魚類如大菱鲆(Scophthalmus maximus)[28]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[29]等研究表明, VE可顯著提高機體抗氧化能力, 降低脂質過氧化產物 MDA產生[29,30]。本實驗得到相似結果, 隨著飼料中 VE含量的增加, 青魚血清T-SOD和CAT活性呈升高趨勢, 血清 MDA含量呈下降趨勢。在中華鱉[17]和建鯉(Cyprinus carpiovarJian)[18]的研究中, VE還能有效提高機體抵抗環境應激的能力, 但暫無關于 VE增強水產動物抗氨氮脅迫的相關報道。本研究結果顯示, 氨氮脅迫雖對各處理組血清CAT活性無顯著影響, 但顯著降低了對照組血清 T-SOD活性, 而飼料中VE能有效緩解氨氮脅迫對血清T-SOD活性的影響。氨氮脅迫還顯著增加了各處理組青魚血清MDA含量, 但62.97和210.45 mg/kg VE組脅迫后MDA含量仍低于對照組。這表明, 飼料中VE可增強機體抗氧化能力, 緩解因氧化脅迫導致丙二醛的產生, 從而能有效增強機體抗氨氮脅迫能力。

下丘腦?垂體?腎間組織軸是魚類應激調節中樞,能釋放促腎上腺皮質激素, 促進頭腎細胞皮質醇激素的合成與釋放, 而皮質醇激素通常不被儲存, 直接進入血液。因此, COR常作為衡量魚體應激強度的指標[13]。在魚類受到外界環境刺激后, 血液中COR明顯升高[19]。有研究結果表明, 動物血液中COR與VE水平呈負相關[31]。但在本研究中, 各處理組血清中皮質醇含量無顯著差異, 這與中華鱉[17]的研究結果相似。氨氮脅迫顯著增加了對照組青魚血清COR含量, 而飼料中VE可有效緩解氨氮脅迫造成的血清COR升高, 脅迫后210.45 mg/kg VE組COR顯著低于對照組。這說明 VE對應激后 COR的升高有明顯抑制作用, 與 VE調節中華鱉[17]、金鯛(Sparus aurata)[31]等受環境脅迫后COR的研究結果相似。

鰓是魚類呼吸、氨氮排泄及滲透調節的主要部分, NKA是鰓組織泌氯細胞及細胞器的膜上存在的一種蛋白酶, 在魚體滲透調節過程中起著非常重要的作用。氨氮脅迫對青魚鰓絲NKA活性可產生顯著影響, 氨氮脅迫6h后, 青魚鰓滲透調節被有效激活,鰓絲NKA活性在6—48h呈上升趨勢[19]。目前, 有關VE對水產動物鰓絲NKA活性的影響無相關報道,但何敏[32]指出, VE可顯著提高斑點叉尾肝胰臟和腸道 NKA 活性, 此外, 在人[33]和大鼠[34]的研究中發現, VE可提高應激下紅細胞NKA活性。本研究顯示, VE對青魚鰓絲NKA活性雖無顯著影響, 但氨氮脅迫使對照組 NKA顯著降低, 而 62.97和210.45 mg/kg VE組 NKA卻無顯著差異且 210.45 mg/kg VE組脅迫后均顯著高于對照組。這說明VE在調節氨氮脅迫后鰓絲NKA活性起到一定促進作用。

綜上所述, VE可促進青魚生長, 其獲取最大生長的有效VE需求為45.0 mg/kg。VE可提高機體血清抗氧化酶活性, 抑制MDA產生, 增加機體抗氧化能力, 還可緩解脅迫對機體的應激強度、對抗氧化系統和滲透調節酶活性的影響, 從而提高機體抗環境脅迫能力。

致謝：

衷心感謝劉巧林、馬曉、金紅春、周偉、劉敏、姚一斌、王曉娜、高巍、金柏濤、何志剛等在實驗樣品采集過程中提供熱心的幫助！

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