鉛鋅尾礦對水稻幼苗生長的影響初探

劉惠娜，蔡碧佳，楊期和，肖迪

嘉應學院生命科學學院，廣東 梅州514015

我國是全球最大的鉛鋅生產國和消費國，但長期以來，由于技術、資金缺乏及管理不善等原因，給礦區周圍的土壤與環境造成了嚴重影響：大量的尾礦、廢渣占用大量的土地資源，日益加劇了人多地少的矛盾；并且導致了土地退化，尾礦中含有大量重金屬，這些重金屬通過地表生物、地球化學作用釋放遷移至土壤及河流中，重金屬污染的水又通過灌溉方式進入農田，最終導致了區域性的重金屬污染、生物多樣性喪失、農作物減產和品質下降，并危害到人體健康等[1-2]。國內外有很多針對礦區周圍的環境狀況展開調查研究，包括尾砂的理化性質的檢測，重金屬含量分析與評價，尾礦庫周邊地區水體環境狀況[2-3]。目前已有諸多研究表明鉛鋅礦污染具有多元素復合污染、元素賦存形式復雜、疊加有化學藥劑的污染、污染具有累積性和不可逆性、部分礦山伴生放射性污染等一般特點[2-5]。

水稻（Oryza sativa L.）是我國最重要的糧食作物之一，種植面積約占糧食作物總面積的30%，產量占50%以上[6-8]。粵東山區是華南地區鉛鋅礦集中地之一，其中規模較大的有梅縣丙村鉛鋅礦、豐順縣尖筆崠鉛鋅礦，近30年來，堆積了大量的尾礦，而在當地，水稻是居民種植的主要糧食作物。鉛鋅尾礦的污染是多種重金屬元素的復合污染，而目前有關重金屬對水稻污染的研究中，大多集中于單一重金屬的污染。由于礦區農田生態環境較為復雜，各種重金屬間往往存在協同、拮抗、屏蔽和獨立作用[9]，致使重金屬影響水稻生長的生理生化效應尤為復雜，其生態效應受多元素的組合、相對濃度及比例等多種因素影響。因此，重金屬復合污染體對水稻生長的影響是一個有待深入研究的前沿問題。本實驗采用粵東鉛鋅尾礦區的土壤與非污染區的土壤混合成不同的基質，通過盆栽試驗，研究鉛鋅尾礦重金屬污染土壤中水稻的生長與生理生化特性的影響，為確定適合種植植物的污染土壤中重金屬土壤所占比例的臨界值，為找到低成本低危害的處理鉛鋅尾礦土的方法提供一定的數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取干燥度一致、飽滿、種皮色澤正常的水稻種子（水稻品種為平遠縣熱柘鎮農村自留種，俗稱“禾米”），經0.1%HgCl2水溶液浸沒消毒2 min，用純水漂洗6次，置28 ℃催芽萌發，播至裝有稻田土（遠離尾礦基本無污染）的培養箱中，按常規培養管理，待兩葉一心時備用。

鉛鋅尾礦土采自梅州梅縣丙村，水稻土采自梅縣東郊村，風干后分別過2 mm土壤篩備用。在水稻土中分別混入質量比例為10%、20%、30%、40%（質量混合比例=尾礦土/（尾礦土+稻田土））的鉛鋅尾礦土。另外，以稻田土為對照，將3 kg混合土裝入塑料盆內，每盆施尿素0.652 g、過磷酸鈣1.00 g、氯化鉀0.4 g。

每盆中移栽水稻5蔸，每蔸1株；重復3次。每天澆灌相同體積的水，隔兩個星期施等量的復合肥。每天觀察記錄植株生長情況，培養30 d后取樣測定生化指標。

1.2 方法

1.2.1 基質化學性質測定

稻田土和鉛鋅尾礦土經風干過篩后，參照王蔭槐的方法測定混合土壤化學性質[10]。土壤速效氮的測定用堿解擴散法、速效磷用鉬藍比色法測定、土壤有機質用K2Cr2O7外加熱法測定、速效鉀用四苯硼鈉比濁法測定。重金屬Pb、Zn、Cu、Cd含量的測定：土樣經王水-高氯酸消化，用原子吸收分光光度計（AA-400，美國 PerkinElmer）測定。

1.2.2 水稻生理生化指標測定

用精確至0.01 cm的卷尺測量株高（株高為地面到最高葉面的距離），計算并記錄分蘗數。

參考郝再彬等的方法測定葉綠素含量[11]。選取第2葉片，剪碎混勻后，用體積分數為95%的乙醇提取，在665 nm、649 nm下測定吸光度，計算葉綠素a、b在葉片中的含量（mg·g-1）。

采用Epson根系掃描儀進行根系掃描及WinRHIZO PRO 2009分析軟件測定根系長度，根表面積，根體積和平均直徑。

參照張志良等的方法測定根系活力[12]。繪制標準曲線y=0.0003x-0.0018（R2=0.9933），根系活力由TTC還原強度，即每克根每小時TTC的還原克數表示。

參照余迪求等的方法進行測定水稻葉過氧化氫酶活性[13]。過氧化氫酶活性用每克水稻葉每分鐘過氧化氫酶分解底物H2O2的毫克數表示。

1.3 數據統計與分析

用Microsoft Office Excel 2003進行數據收集和處理，用SPSS16.0數據處理軟件系統進行單因素方差分析，多重比較采用Duncan檢驗法。

2 結果與分析

2.1 不同比例的混合土壤的化學性質

不同比例混合的土壤的基本理化性質及對照土壤的重金屬含量如表1，結果說明：N、P、K、有機質的含量隨著鉛鋅尾礦土的比例增加而逐漸減少。除水稻土中Zn>Pb，在同種土壤中，重金屬含量順序均為Zn>Pb>Cu>Cd，且重金屬含量遠超對照土壤，10%的尾礦中的Zn約為對照組的20倍，Pb高出近6倍，而Cu、Cd則高出對照2~3倍。

表1 不同比例尾礦混合土壤的化學性質 Table 1 The chemical properties of mixed soil with different proportions of tailing soil

2.2 不同比例的混合土壤中水稻幼苗的分蘗數和株高

表2 不同混合土壤中幼苗的分蘗數和株高 Table 2 The tiller number and height of seedlings in different mixed soil

由表2可知，隨著鉛鋅尾礦土質量含量的增加，分蘗數和株高逐漸減少。當尾礦土質量比例為30%~40%時，分蘗數極顯著地低于對照，10%~20%時與對照相比，則無顯著差異；當混合比例為10%和20%時，兩種土壤上生長的幼苗株高無顯著差異且均低于對照，但總趨勢為混合比例越高，苗株越矮。當尾礦土質量比例較低時（10%），對分蘗的抑制程度較低（為對照的91.5%），對株高的抑制程度卻較大（為對照的77.0%），但比例較高（20%~40%）時，對分蘗的抑制程度則高于株高。

表3 不同混合比例土壤中幼苗葉片的葉綠素含量 Table 3 The chlorophyll content of seedling leaves in different mixed soil

2.3 不同混合比例的土壤中水稻幼苗葉片葉綠素含量

隨著鉛鋅尾礦土混合比例的增加，水稻幼苗的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b的平均值總體上呈現出逐漸下降的趨勢（表3），但多重比較表明在混合比例較高的3種土壤（20%、30%和40%）中，3項數值在3種土壤之間并無顯著差異。在3種混合土壤中，前述3項葉綠素含量的最大值均出現在混合比例為10%的土壤中，約為對照組的67.5%，葉綠素a顯著低于對照組，但與比例為20%、30%、40%的土壤相比，則無顯著差異；對照土壤中，幼苗葉綠素b含量顯著高于20%、30%、40%的土壤，但與10%的無顯著差異，而葉綠素a+b總量顯著高于四種混合土壤，且40%的土壤中，幼苗葉綠素a+b總量顯著低于10%的土壤。

在7~14 d栽培階段，鉛鋅尾礦土對水稻外部形態影響差異不大，但15 d后，鉛鋅尾礦土質量超過30%的土壤中的幼苗開始顯現出生長較緩慢的現象，分蘗較少，苗株較矮，而且組間差異明顯；葉脈間還出現缺綠病，葉尖卷曲，在葉邊、葉鞘基部出現少量的褐色斑點，而在尾礦土為10%~20%的幼苗并未出現這些癥狀。葉綠素a/b比值在混合比例為10%的土壤與對照幾乎相同，為2.67，而在20%、30%和40%的土壤中則分別為4.04、2.73和5.85，比值均高于前兩者。

2.4 不同比例的混合土壤中水稻幼苗根系生長的形態指標

2.4.1 水稻幼苗的根系總長和根系直徑

由圖1和圖2可知，水稻幼苗的根系總長與平均直徑隨著混合比例的升高而呈下降趨勢。對于幼苗的根系總長，在各種混合土壤中，均顯著低于對照組，且五種土壤間均差異顯著；根系平均直徑隨尾礦土的比例升高而逐漸降低，但30%與40%并無顯著差異。

2.4.2 水稻幼苗的根系總表面積和總體積

圖1 不同混合土壤中幼苗的根系總長Fig.1 The total length of seedling in different mixed soil

圖2 不同混合土壤中幼苗根系的平均直徑Fig.2 The average root diameter of seedling in different mixed soil

圖3 不同混合土壤中幼苗的根系總表面積Fig.3 The total root surface area of seedling in different mixed soil

圖4 不同混合土壤中幼苗根系體積Fig.4 The root volume of seedling in different mixed soil

由圖3和4可見水稻幼苗的根系表面積、總體積因混合比例的不同而有不同程度的下降。在混合土壤中，根系表面積和總體積均在混合比例為10%的土壤中達到最大值，為對照的近80%、50%。不同比例的土壤中，幼苗根總長差異顯著；但根系體積，比例為20%、30%、40%的3種土壤間差異不明顯，且均顯著低于10%的土壤。

2.5 不同混合比例的土壤中水稻幼苗的根系活力

由圖5可知，四種土壤中幼苗的根系活力均低于對照，且尾礦土的比例越高，根系活力越低。多重比較表明，除20%與30%之間沒有顯著差別外，其它各處理間差異顯著。

圖5 不同混合土壤中幼苗的根系活力 Fig. 5 The root activity of seedling in different mixed soil

2.6 不同比例的尾礦對水稻葉過氧化氫酶活性的影響

從表6可見，在四種混合土壤中，幼苗葉片的過氧化氫酶（CAT）的活性除了在尾礦土占10%的土壤中顯著高于對照外，其他混合土壤中均低于對照，且比例為20%、30%和40%的土壤，前兩者、后兩者均無顯著差異。

圖6 不同土壤中幼苗葉片的過氧化氫酶活性 Fig.6 The CAT activity of seedling leaves in different mixed soil

3 討論

本研究中，四種混合土壤的重金屬含量均遠超過遠離污染區的稻田土壤，已達到嚴重污染的水平。植物吸收重金屬進入細胞，細胞內的重金屬離子不僅能與酶活性中心或蛋白質中的巰基結合，而且還能取代金屬蛋白中的必需元素（Ca2+、Mg2+、Zn2+和Fe2+），導致生物大分子構象改變，酶活性喪失及必需元素缺乏，干擾細胞的正常代謝過程，從而導致毒害[1,3,14]。雖然重金屬毒性較大，N、P、K、有機質等養分貧瘠，會抑制水稻幼苗的生長，但由于在栽培期間加入了適量的尿素、磷酸鈣和氯化鉀，并每周施加一次復合肥，保證了一定的營養條件，所以在不同混合比例的土壤中均能生長。

重金屬Cu、Cd、Hg對作物產生傷害的臨界濃度普遍較低，如Cu對大麥、小麥、油菜等產生毒性的臨界濃度為19~21 mg·kg-1，有研究認為水稻幼苗遭受Cu中毒的臨界濃度約為35.l mg·L-1[6,8,15]。在本研究中，混合土壤中Cu濃度為66~192 mg·kg-1，遠超中毒的臨界值，因此對幼苗的各項測定指標有顯著的抑制作用。葛才林發現水稻的種子萌發過程對重金屬脅迫很敏感，發芽率隨Cu2+、Cd2+濃度升高而呈指數下降，萌發后的幼苗形態建成又是一個敏感時期，尤其以根發生和生長期最為敏感。在營養生長盛期，重金屬脅迫對分蘗發生的抑制程度最高，但Cu2+、Cd2+對株高的影響則較小，只有當濃度較高時才表現出明顯的抑制作用[8]。本研究證實，尾礦土比例較小即重金屬濃度較低時，分蘗數和株高受抑程度較小，但隨著濃度的不斷增大，分蘗的受抑程度顯著高于株高，即較高濃度的重金屬對分蘗的抑制顯著高于株高。肖清鐵以耐Cd水稻品種為材料，用濃度為0、50和100 μmol·L-1的Cd2+水培液處理7 d后，發現50 μmol·L-1對生長無顯著影響，100 μmol·L-1則顯著抑制其生長，株高抑制率為10%~20%[16]。本研究中，10%~40%比例的混合土壤中，Cd約為44~102 mg·kg-1，株高抑制率為13%~54%。無論是土壤中還是水培液中，當Cd含量較低時，其抑制作用均較弱。周泳等發現：水稻在分蘗期，在酸性紫色土中，低濃度Pb對生長無不良影響，至1000 mg·kg-1時才表現出對株高、分蘗的抑制；3000 mg·kg-1時，生長明顯矮化、分蘗少，葉片縮小；收獲時，1000 mg·kg-1Pb使株高較對照低10%，有效穗低27%~54%。但在中性、石灰性土壤中，生長明顯受抑制的Pb濃度要高l級處理水平[17]。在本研究中，如果僅從不同混合比例的土壤中Pb含量來分析，即使在尾礦土占40%的土壤中，Pb也只有1049 mg·kg-1，但分蘗、株高明顯要低75%和45%。，因此，重金屬對幼苗生長的影響與土壤的其他理化性質有關。

葛才林等發現在水稻的發育過程中，水稻的根的伸長和分蘗均受Cu2+、Cd2+和Hg2+脅迫的顯著抑制，但不同的重金屬影響不同，根系生長、分蘗發生抑制程度的大小順序為Cu2+> Cd2+>Hg2+[8]。何俊瑜等采用水培法，探討不同濃度Cd（0、l、5、10、25、50、100 μmol·L-1）對水稻幼苗根系生長的影響，發現1 μmol·L-1Cd處理對2個水稻品種根系生長有一定的促進作用，表現為植株干質量、根系總長度、根系表面積、根體積和根系活力均略有升高。但隨著Cd濃度（5~100 μmol·L-1）增加，表現出一定的抑制效應，但當濃度增至10、25 μmol·L-1，根系干質量、根系總長度、根系表面積、根體積和根系活力明顯受到抑制，而根系平均直徑、質膜透性均有所增加。同時，也證實不同的水稻品種對Cd脅迫存在著一定的差異[18]。本研究中，稻苗的根系總長和平均直徑在混合土壤中均低于對照，且隨混合比例的增大而下降，可能與土壤中的重金屬脅迫是Cu、Cd、Zn、Pb等的復合污染有關，復合污染通常被認為會加重對作物生長的抑制作用[19]。當然，與品種不同也有關。

馬朝紅和曾得生將水稻幼苗水培于5、10、20 mg·kg-1的Cd2+溶液中，1周后測定根的伸長生長，根在5 mg·kg-1溶液為對照的20%~75%，在10 mg·kg-1中為5%~50%，20 mg·kg-1時僅有0~10%。在分孽前期，隨著土壤中Cd2+濃度的升高，Cd2+對分蘗的抑制增強，一般在插秧后15 d左右表現出來，進入分蘗盛期，這種抑制更明顯[20]，這與本研究觀察的結果相似。本試驗中，在幼苗生長的早期階段（7~14 d），不同土壤中的形態差異不大，但隨著生長期延長，差異日趨顯著。尾礦中對幼苗生長影響的主要源自重金屬及其化合物，15 d后，尾礦土比例超過30%的土壤中，幼苗分蘗數較少、植株較矮。在30%、40%的混合土壤中，幼苗表現出明顯的病態，而在10%、20%的土壤中，受害癥狀并不明顯，這與顧淑華等[21]、黃秋蟬等[22]的結果相似。楊清偉等對利用鉛鋅礦廢水約50年的灌溉農田中Pb、Zn、Cu和Cd在土壤-植物系統中的分配及其生態影響進行研究，發現土壤中4種重金屬含量的平均值分別是背景值的4倍、5倍、近4倍和l4倍多；對土壤的污染程度分別為中-重度污染、重度污染、輕微污染和重度污染。種植水稻的土壤Pb（528~2840）、Zn（474~3292）、Cu（308~3026），對水稻株高、分蘗數、生物量等均具有毒害作用[3]，這與本研究的結論是一致的。

Cd2+、Cu2+對葉片葉綠素含量的影響較Cd2+大，而且Cd2+在低濃度時還能促進葉片葉綠素含量的增加，在濃度較高時才引起葉綠素含量的降低。Cd2+和Hg2+在低濃度時（<40 mg·kg-1）促進水稻幼苗葉片葉綠素含量增加，高濃度時則抑制葉綠素合成[14-15]。本研究中所采用的混合土壤，Cd最低含量為43.58 mg·kg-1，其上生長的幼苗葉片葉綠素含量均低于對照。有研究證明實水稻葉片對Cu2+則很敏感，低濃度時就表現為抑制效應，所以在混合土壤中葉綠素較低就不難解釋了。葉綠素a/b也是衡量光合作用的一個重要指標，a/b值上升說明了葉綠素a含量下降速度低于葉綠素b。因為在光合色素中，葉綠素a是天線色素，又是參與光反應的中心色素，因而其含量高低對光合作用更為重要。葉綠素a/b值在重金屬離子濃度低時增加，濃度高時降低，王澤港等認為這是植物對重金屬離子毒害的適應性反應。在低濃度脅迫時，葉綠素a表現出較強耐性，而隨著脅迫濃度的增加，葉綠素a的含量迅速下降，導致a/b值降低，從而導致整體的光合速率下降。高濃度的Cu2+、Cd2+和Hg2+可造成葉片PSⅡ、PSⅠ及捕光色素-蛋白質復合體含量大幅降低，也可造成葉綠素含量的下降以及葉綠素比值的改變，進而抑制光合速率[15]。但在本研究中，尾礦土比例為10%的土壤中，葉綠素a/b與對照幾乎相同，但在比例為20%~40%的土壤反而有所上升，水稻葉片的這種反映不同于前述結論，可能與重金屬種類較多（重金屬復合作用）、作物的生長階段有關。

重金屬可能與植物體內的某些酶進行螯合，破壞酶的活性[8]。劉向蕾證實，在Cd的毒害下，可誘導水稻幼苗葉片細胞自由基產生，保護酶活性降低，脂質過氧化產物含量增加[23]；陳平等發現Cd濃度在0~10 mg·L-1范圍內，水稻葉片的脂質過氧化產物和過氧化物酶活性隨Cd濃度增加而增加，而超氧化歧化酶活性和過氧化氫酶活性隨著Cd濃度增加而降低[14]；丁園等將稻苗培養在Cd濃度為10 mg·L-1時，其根系活力降低。低濃度Pb處理能夠促進植物正常的生理代謝活動，如莖葉內硝酸還原酶活性、可溶性糖和葉綠素含量均有不同程度的增加，但隨著濃度的升高，水稻秧苗的生長發育則明受抑[24]。本研究中，在混合比例10%的土壤中，水稻幼苗葉片過氧化氫酶活性高于對照，但混合比例超過10%后，該酶酶活性則低于對照。重金屬脅迫下植物體內，有關酶活性的變化，目前的文獻報道有2種情況：一種是酶活性隨著重金屬濃度的增加而增大，另一種是隨著重金屬濃度的增加，酶活性先升后降或持續下降[23-25]。本實驗的結果與后者相同。水稻幼苗的根系活力在混合土壤中也顯著低于對照，可能是因為過高濃度的重金屬引起酶蛋白變性，使其活性受抑制，而導致根系活力下降。當然，尾礦土含有的重金屬較多，除了Cu、Zn、Pb、Cd之外，還有As、Hg、Ni等，這種重金屬的復合脅迫機制是極其復雜的，不僅因其所含的重金屬種類有關，而且與不同重金屬含量有關，而且對不同作物生長發育的影響也會不同，其相關作用機理問題，還有待于進一步深入研究。

4 結論

本研究中，四種混合土壤的重金屬含量均遠超過遠離污染區的稻田土壤，已達到嚴重污染的水平，且尾礦土所占比例越高，重金屬含量也越高，潛在的污染也越重。在離尾礦很近的區域，土壤的污染應不容忽視。與對照相比，含10%鉛鋅尾礦土的混合土壤上生長的水稻幼苗，其分蘗數、株高、葉綠素b無顯著差異，但葉綠素a、葉綠素a+b、根系總長、根直徑、根系總表面積及體積、根系活力偏低，且過氧化氫酶活性較高，當尾礦土混合比例超過20%，前述各項形態和生理指標均顯著低于對照，且隨著尾礦土的比例升高，數值也降低。當超過20%時，表現出明顯的受害征狀，且比例越高，受害越嚴重。因此，在粵東鉛鋅尾礦區，尾礦土將經由雨水沖刷帶入稻田土壤中，會給稻苗的生長發育帶來不良影響，尤其是尾礦集中堆積區域附近的稻田，對這些尾礦的治理已成為當務之急。

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