甲烷氧化菌群共代謝降解TCE的動力學研究

張麗杰，胡慶梅，邢志林，全學軍，趙天濤

(1.重慶理工大學，重慶 400054;

2.北京迪威爾石油天然氣技術開發(fā)有限公司，北京 100085)

三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)通常被企業(yè)用作金屬部件、電子部件的清洗溶劑和脫脂劑等，也可作為萃取溶劑、化工原料和織物干洗劑等。我國TCE的使用量很大，2010年TCE的表觀消費量已達到15.07萬噸，并且在每年持續(xù)增加中［1］。TCE應用廣泛，在水體、土壤和空氣中均能檢測到TCE［2－5］。大量研究表明:TCE 具有很強的環(huán)境毒性，對大鼠具有致癌作用，在長期暴露下對人體是有害的［6］。美國環(huán)境保護署(EPA)在1976年就已將TCE列入“優(yōu)先控制化合物”和“疑似致癌物質(zhì)”［7］名單。我國常見污染地下水的有機物有25種，而TCE是最常見的鹵代物［8］。

近年來，國內(nèi)外學者采用不同方法對TCE進行處理［9－15］，主要包括物理修復、化學修復和生物修復三方面。EPA已將空氣吹脫法和顆粒狀活性碳吸附法確定為治理被TCE污染的地下水和工業(yè)用水的最經(jīng)濟的方法。但是，這些方法不能永久地去除有毒污染物，而只是簡單地將污染物由一個介質(zhì)轉(zhuǎn)移至另一個介質(zhì)。生物修復能將有毒污染物轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)，與傳統(tǒng)的“抽出－處理”修復方法相比，地下水生物修復可以使清理成本降低50～75%，而與傳統(tǒng)的“挖出－焚燒”技術相比，土壤生物修復的花費僅為其十分之一。因此，生物修復是一種具有廣闊應用前景、經(jīng)濟且環(huán)境友好的修復技術。

微生物降解TCE的代謝機制是近20年的研究熱點［16－18］。好氧條件下，甲烷氧化菌、甲苯氧化菌和苯酚氧化菌等微生物可降解TCE。甲烷單加氧酶(MMO)可首先將TCE氧化為環(huán)氧化合物，然后在水中開環(huán)，生成二氯乙酸、醛基乙酸及一個碳原子的產(chǎn)物(CO、HCOOH)，再進一步被氧化為CO2。總體而言，好氧代謝產(chǎn)物無毒性，且比厭氧還原脫氯的降解速率更快。

本文主要研究甲烷氧化菌群靜息細胞(沒有外來能源的條件下)對三氯乙烯(TCE)降解的影響，并推導共代謝降解TCE的動力學模型［19］，以期通過動力學參數(shù)的求取和分析在理論上深入理解甲烷氧化菌群降解三氯乙烯的能力及對三氯乙烯的親和力，為工程應用打下基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

NMS培養(yǎng)基的組成如下:KH2PO41.0 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9 g/L，MgSO4·7H2O 0.32 g/L，(NH4)2SO43.0 g/L，微量元素溶液10 mL，蒸餾水990 mL，pH=6.8。微量元素溶液組成如下:ZnSO4·7H2O 0.287 mg/L，MnSO4·7H2O 0.223 mg/L，H3BO30.062 mg/L，Na2MOO4·2H2O 0.048 mg/L，COCl2·6H2O 0.048 mg/L，KI 0.083 mg/L，CaCl2·2H2O 3.5 mg/L。

選取上海老港垃圾填埋場已填埋10年的礦化垃圾。取4 mm篩下和2 mm篩上垃圾顆粒約100 g，置于500 mL血清瓶后具塞密封，用甲烷氣體80 mL置換瓶中空氣，30℃密閉馴化2周實現(xiàn)甲烷氧化菌的復壯。

1.2 菌種活化及富集

稱取礦化垃圾1 g放入100 mL NMS培養(yǎng)基中，置于30℃、160 r/min搖床振蕩2 h。靜置1 h后得到菌懸液。取菌懸液2 mL作為種子接入分裝了20 mL NMS培養(yǎng)基的100 mL血清瓶中，用內(nèi)襯硅膠/聚四氟乙烯膠塞封口，外加鋁蓋密封。用20 mL甲烷氣置換瓶內(nèi)20 mL空氣，然后在30℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3～5 d。

將處于指數(shù)生長期的菌液轉(zhuǎn)移至10 mL的離心管中，使用低溫離心機進行離心(溫度3～5℃，轉(zhuǎn)速3000 r/min，時間為5 min)。在無菌操作間倒掉離心管中上清液，加入滅過菌的NMS培養(yǎng)基清洗菌液，然后再進行低溫離心，在無菌操作間中倒掉上清液。富集的甲烷氧化菌液中無甲烷，處于靜息狀態(tài)，備用。

1.3 分析測試

采用氣相色譜SC－6000A(配ECD檢測器)檢測三氯乙烯濃度。色譜柱:GDX－1 042 m;氮氣為載氣，載氣流速:35 mL/min;尾吹氣速:10 mL/min;進樣器(汽化室)溫度:120℃;柱箱溫度(柱溫):80℃;檢測器溫度:200℃;進樣量:0.1 mL;基流補償0.00 nA。

1.4 甲烷氧化菌群降解TCE的動力學模型

所謂共代謝就是指原本不能被代謝的物質(zhì)在外界提供碳源和能源的情況下被代謝的現(xiàn)象。其中外界提供的能源稱為一級基質(zhì)，用于微生物細胞增長，并為微生物細胞活動提供能量。被共代謝的物質(zhì)稱為二級基質(zhì)，不用于微生物細胞增長，也不能為微生物細胞活動提供能量。

在模型推導過程中做如下假設:將甲烷氧化菌群利用甲烷(一級基質(zhì))進行增殖培養(yǎng)，至其指數(shù)期后利用靜息細胞降解鹵代烴;鹵代烴是二級基質(zhì)，既不能作為碳源也不能作為能源。在降解過程中，菌體濃度基本保持不變，即CX為一常數(shù)。基于以上假設，單底物酶催化反應的動力學特性往往服從Michael-Mentonno模型，可用于描述TCE的代謝，即:

式(1)中:rs為 TCE 的降解速率(mg/min);qs，max為TCE最大比消耗速率，即單位時間內(nèi)單位質(zhì)量菌體降解TCE的質(zhì)量(min－1);KS為半飽和常數(shù)，其值大小表征細胞與底物的親和作用(mg/L);CX為菌體濃度(mg/L);CS為TCE濃度(g/L)

用L－B雙倒數(shù)法可求取qs，max和Ks。對于分批操作采用time-step法處理實驗數(shù)據(jù)，具體如下:式(1)兩邊同時除CX并取倒數(shù)得:

根據(jù)提供的實驗數(shù)據(jù)，在很短的實驗時間間隔內(nèi)，式(2)中rs可近似表示為

Cs取Δt范圍內(nèi)的平均值，即，X基本上不變，為常數(shù)，則式(2)為:

2 結(jié)果及討論

2.1 菌體干重與菌液吸光度的線性擬合

將裝有100 mL MS液體培養(yǎng)基的血清瓶加入5 mL混合菌液，抽取100 mL空氣，再充入100 mL甲烷，進行恒溫震蕩培養(yǎng)(30℃、160 r/min)。培養(yǎng)一天后抽取菌液在600 nm波長下測吸光度，間隔30 min。同時將5 mL菌液放入培養(yǎng)皿烘干至恒重，得到干重質(zhì)量。每組實驗進行2～3次，確保平均誤差小于5%。由圖1可知:混合菌濃度CX吸光度OD600nm線性關系很好，可決系數(shù)達到了0.993 1。線性方程為 y=2.934x+0.0436，式中 x是菌液吸光度OD600nm，y是菌體濃度CX，單位為g/L。經(jīng)過活化和富集的混合菌液OD600nm=0.574±0.001。由圖1可知富集后的混合菌液濃度為1.728 g/L。

圖1 混合菌液吸光度與菌體濃度擬合

2.2 甲烷氧化菌群對TCE的降解效果

將10 mL TCE加入120 mL滅菌的去離子水中，再加入玻璃珠振蕩，靜止10 min后，抽取飽和TCE溶液。取裝有100 mL菌液的血清瓶加入上述飽和TCE溶液1 mL，25℃下放置4 h，使TCE達到氣液平衡。然后加入10 mL菌液(CX=1.728 g/L)，頂空取樣后利用氣相色譜ECD檢測TCE的濃度變化，由亨利定律可換算得到TCE的液相濃度［20］。每組實驗進行2～3次，確保平均誤差小于5%，對照組不加入菌液。TCE隨時間變化的降解曲線如圖2所示。。

圖2 TCE隨時間變化的降解曲線

由圖2可見:甲烷氧化菌群的靜息細胞在6 h內(nèi)將初始濃度為45.5 mg/L的 TCE降解至9.5 mg/L，降解總量達到了3.6 mg，降解率達到79%。

2.3 甲烷氧化菌群降解TCE的動力學推導

根據(jù)時間步長法推導動力學模型方程，在實驗中得到如表1所示的數(shù)據(jù)。表中:Csg表示血清瓶中氣相TCE的濃度，單位為mg/L;CsL表示血清瓶中液相TCE的濃度，單位為mg/L，根據(jù)25℃亨利系數(shù) H 為1.04×10－3(MPa·m3/mol)換算得到［20］;ΔCsL表示在測量間隔內(nèi)兩次 TCE的濃度差，單位為mg/L;表示在測量間隔內(nèi)底物TCE的平均降解速率，單位為mg/(L·min);Δt為測量時間間隔，單位為min;表示測量時間間隔內(nèi)底物TCE的平均濃度，單位為mg/L。

表1 甲烷氧化菌群菌降解TCE動力學數(shù)據(jù)

根據(jù)圖3可看出CX/rs－1/CS的線性關系良好，可決系數(shù) R2=0.961，說明 TCE降解符合Monod方程。由方程的截距和斜率，再根據(jù)圖3可以求出 qs，max=1.51 ×10－4min－1，KS=2.58 mg/L，其降解動力學方程為:對于前期報道的甲烷氧化菌OB3b，當TCE初始濃度為0.66～32.9 mg/L時，半飽和常數(shù) KS為 19.1 mg/L［21］;初始濃度為0.06 ～8.0 mg/L 時，半飽和常數(shù) KS為 10.8 mg/L［22］。通過比較可知，本實驗所用的甲烷氧化菌群的半飽和常數(shù)KS是1.5 mg/L(TCE初始濃度為45.5 mg/L)，明顯小于OB3b菌，說明該甲烷氧化菌菌群對TCE有更強的親和力，且轉(zhuǎn)化總量高，可達到 3.6 mg，而 Lisa［16］報道的甲烷氧化菌群最大轉(zhuǎn)化總量僅為0.4 mg/瓶。

圖3 氯代烴降解動力學擬合

3 結(jié)束語

在甲烷、甲醇、乙醇、苯酚等碳源和能源同時存在的情況下，甲烷氧化菌可以利用甲烷單加氧酶共代謝降解氯代烴，這對被氯化物污染過的土壤、地下水或空氣來說具有重要意義。共代謝動力學很復雜，且受到底物、產(chǎn)物的數(shù)量和濃度以及它們之間的抑制競爭關系等因素影響。在共代謝過程中會不可避免地發(fā)生副反應，產(chǎn)生對微生物有害的物質(zhì)，從而降低氯化物的降解速率。探討共代謝過程中影響降解速率的動力學參數(shù)因素，研究其動力學規(guī)律對修復被氯化物污染的工業(yè)產(chǎn)物具有重要的意義。

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