臭氧參與NAD+/NADH氧化還原反應機理的理論研究

田文欣

(陜西廣播電視大學，西安 710068)

1 NADH對生物分子的作用機理

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)及其還原形式(NADH)是一類重要的氧化還原輔酶。在生物體內，NAD+和NADH在酶的催化下通過奪氫或給氫能將特定的物質氧化或還原，為能量的存儲和釋放提供必要的準備，是細胞能量代謝所必需的輔酶。生物體內的許多氧化還原反應和代謝過程都離不開它們的參與，其中，NAD+和NADH參與的多酶氧化還原體系是生物體細胞呼吸鏈中電子傳遞過程的主要生物氧化體系，糖、脂、蛋白質三大代謝物質分解時的氧化反應絕大部分也都是通過這一體系完成的，例如，糖酵解、三羧酸循環和線粒體呼吸鏈中的氧化還原反應。

NADH的主要功能是實現電子傳遞。具有還原性的化合物如葡萄糖被氧化后會釋放能量，這些能量被轉移到 NAD+上，發生還原反應成為NADH，該反應是糖酵解和三羧酸循環的一部分。在真核生物中，NADH與NAD+之間的轉化是一個最重要的生物氧化還原反應。例如，在線粒體中的電子轉移鏈中，NADH作為富能電子轉移輔酶參與ATP的合成。監視NADH的氧化還原狀態是表征活體內線粒體功能的最佳參數。NADH結構見圖1。

圖1 NADH結構

NADH的氧化和還原形式均被設置于反應的連接作用中，可運送電子從一個反應到另一個反應。因此，該輔酶在細胞中有2種形式:NAD+是一種氧化形式，它從其他分子上獲得電子而被還原為NADH;NADH又可被用來做還原劑提供電子。NADH的反應活性中心是l，4－二氫吡啶環，它轉移形式上的負氫，將底物還原，而本身被氧化成吡啶鹽的形式。這些電子轉移反應是NADH的主要功能。NAD+/NADH氧化還原對擔當整個反應中氫化物2個電子和1個質子的來源和受體。反應過程見圖2。

圖2 NAD+/NADH氧化還原反應

該反應是可逆的，意味著輔酶可持續地在兩種形式之間循環而沒有消耗。

關于輔酶NADH上的負氫轉移究竟是通過什么歷程完成的，以及負氫將底物還原的機理，長久以來一直是學術界爭論的焦點問題。目前普遍被認同的主要有2種機理:一步負氫轉移機理(極性機理)，反應不經過自由基中間體過程;以電子轉移為先行步驟的多步轉移機理(電子轉移機理)，它又可分為e－H轉移和(e－H+－e)轉移2種情況。

Jan Grodkowskl等［1］于1983 年研究了 NAD·/NADH對的單電子轉移反應，指出在沒有酶參與的情況下，NAD+可能的電子轉移的2個步驟為:

其中第1步單電子還原反應已通過脈沖射解作用被研究證實，在中性溶液中測得NAD+/NAD·對的氧化還原電勢E= －0.92 V。

由于輔酶NAD+及NADH在生物體內所起到的重要作用，有關它們的研究己經成為生物和化學及其他相關領域的重要課題。人們在關注NADH固有的循環代謝的同時，外來因素對NADH氧化還原反應歷程的影響也引起了相關學者的研究興趣。

2003年Zielonka等［2］在NADH與二溴化物自由基(Br2·－)的氧化反應中，觀測到NADH·+自由基陽離子和去質子化形式(NAD·)的存在，說明該反應包含電子轉移步驟:

2008年 Ekaterina等［3］指出:NADH 氧化還原反應機理的建立取決于氧化劑，有機氧化劑比如醌類和一些四氮雜苯趨向于一步負氫轉移反應路徑，而單電子無機氧化劑則趨向于連續的電子轉移路徑。

可以看到，反應條件的改變和反應物結構的改變都有可能改變反應機理。

2 臭氧對生物分子的作用機理

臭氧(O3)為光化學煙霧中的主要成份，約占90%左右，有強烈的刺激性和氧化性，是現代城市的重要環境污染物之一。O3除來源于交通廢氣外，還可由許多電器(如電視機、復印機、負離子發生器等)及衛生消毒器材(如紫外線燈、O3消毒保鮮除臭系列產品)產生。

O3的毒性是由于其氧化性所致。被吸入機體后，O3可引起活性氧自由基的產生，與多數細胞組件反應，包括蛋白質、脂肪和DNA等大分子化合物，導致脂質臭氧化作用，使不飽和脂肪酸氧化為脂肪酸的過氧化物，從而造成細胞損害。與此同時，臭氧在醫療衛生方面卻有著積極的作用。一方面，臭氧可以對傷口進行殺菌消毒，促進細胞的新陳代謝;另一方面，臭氧也可以用于疾病的治療。

近年來，多家研究小組致力于研究臭氧對NADH的作用和影響。通過將小鼠暴露在一定濃度的臭氧環境下來檢測肺部細胞內 NAD+和NADH的濃度變化，進而揭示臭氧對細胞代謝和生理過程更深入的影響，探究用于疾病治療時臭氧的作用機理。

臭氧作為一種強氧化劑，本身不是活躍的物種，不像分子氧可以呈現雙自由基.O－O.，臭氧可視為O=O－O結構。

1994年William［4］對臭氧在肺部與目標分子反應形成自由基的機理進行了分類研究，指出臭氧本身不是自由基，因它作用產生自由基具有兩種完全不同的機理:一個包含臭氧與烯烴的反應;另一個是與給電子體比如谷胱甘肽的反應。

當臭氧與水溶性給電子體作用時，可產生臭氧自由基陰離子，這個短暫的自由基陰離子迅速被質子化，分裂成羥基自由基:

O3/對的還原電勢是1.6 V，因此臭氧與硫醇和苯鄰二酚類化合物，以及許多其他生物電子供體的電子轉移反應是熱力學可行的。

1999年Martin等［5］研究了一系列酚類的木質素結構化合物與臭氧反應，發現其自由基形成的速率常數與這些自由基單電子還原反應電勢呈線性關系，說明臭氧與這些化合物是通過電子傳遞而作用的，并提出一種可能的路徑(見圖3)。

圖3 臭氧與芳香族木質素結構的初級反應機理

臭氧與芳香族木質素結構的反應是一個完整的電子轉移過程，引發芳香族陽離子自由基和臭氧自由基的形成，質子化作用后臭氧自由基分解得到氧氣和羥基自由基。

目前，通過實驗對臭氧和NADH直接作用的機理研究還沒有相關報道。由于實驗條件的限制，大部分研究只涉及到細胞中NADH對臭氧刺激的響應，因此很有必要通過理論模擬手段揭示此反應的作用機理。借助計算機技術、量子化學計算方法和各種動力學理論研究動力學反應的機理及動力學性質不但可對已有的實驗研究起到理論補充和證實，而且為進一步的實驗研究提供理論依據。

3 采用理論化學方法研究臭氧參與NAD+/NADH氧化還原反應的機理

為了方便研究和闡述輔酶NADH氧化還原反應歷程，大量NADH的模型物被合成，以應用于機理研究。本文選取甲基取代煙酰胺環上的腺苷二磷酸核糖的構型來進行機理分析。

基于文獻調研，在生物體內存在NADH、NAD·、NAD+三種形式，臭氧參與NAD+/NADH氧化還原反應的總反應為

可能的機理為:

對于該反應體系，主要對步驟(1)的質子轉移反應進行直接動力學研究。采用密度泛函方法優化各駐點的幾何結構和頻率，在優化好的構型下計算能量，根據反應物、中間體、產物的性質尋找設計過渡態，將過渡態優化并計算勢能，構建勢能面，得到最佳反應路徑。

在對NADH進行構型設計時，煙酰胺環上酰胺基上的氫與吡啶環上的活性氫分別呈順式和反式2種結構(見圖4)。臭氧可能與NADH的2種構型均發生反應，所以要同時考慮順、反結構上的作用情況，并對這2種情況下的反應進行比較。

圖4 NADH兩種幾何構型

對于NAD·→ NAD+的電子轉移反應，可以先對NADH、NAD· 、NAD+進行NBO分析，由電荷分布情況為電子轉移提供參考依據。

4 結束語

臭氧參與NAD+/NADH氧化還原形式轉化的機理研究可為實驗提供更多的理論依據，彌補由于實驗限制而無法進行的一些瞬態反應，有助于從本質上深入了解臭氧與生物分子相互作用產生自由基的機理和轉化規律。在理論方面關于臭氧與生物分子的反應，目前大部分報道都是臭氧加成到不飽和鏈上或環上，對于參與生物分子氧化還原形式轉化的動力學機理還未見報道。因此，該項研究有助于擴充生物反應的理論數據，提升生物反應動力學的研究水平。

［1］Jan Grodkowskl，Neta P，Brian W.Carlson，et al.One-E-lectron Transfer Reactions of the Couple NAD·/NADH［J］.The Journal of Physical Chemistry，1983，87(16):3135－3138.

［2］Jacek Zielonka，Andrzej Marcinek，Jan Adamus，et al.Direct Observation of NADH Radical Cation Generated in Reactions with One-Electron Oxidants［J］.The Journal of Physical Chemistry A，2003，107(46):9860 －9864.

［3］Ekaterina V，Bakhmutova-Albert，Dale W，et al.Chlorine Dioxide Oxidation of Dihydronicotinamide Adenine Dinucleotide(NADH)［J］.Inorganic Chemistry，2008，47(6):2205－2211.

［4］William A P.Mechanisms of Radical Formation From Reactions of Ozone With Target Molecules in the Lung［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，1994，17(5):451－465.

［5］Martin Ragnar，Tord Eriksson，Torbjorn Reitberger，et al.A New Mechanism in the Ozone Reaction with Lignin Like Structures［J］.Holzforschung，1999，53(4):423－428.