3－硝基酪氨酸人工抗原的合成與鑒定

彭方毅，楊海艷，姜海蓉，徐建建，伍 娟，周 歡，袁兵占

(1.重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054;2.重慶市江津區中心醫院，重慶 402260)

3－硝基酪氨酸(3NT)是機體在氮氧化物存在的條件下氧化損傷的一種特殊形式，非常穩定［1］，常常在病理狀態下伴隨活性氧和活性氮的增加而產生，是活性氮(RNS)對蛋白酪氨酸殘基氧化修飾的產物，也是體內RNS形成的重要生物標志物［2－3］。目前，3NT的檢測方法主要有高效液相色譜法［4－6］及氣相與質譜聯用法等，但這些方法需要對樣品進行處理，較為復雜，費時費力，且影響檢測的準確性［7－8］，重復性差，靈敏度低，缺乏選擇性，不適用于現場大量樣本的快速檢測。因此，人們迫切需要一種簡便、快速、廉價及適合多樣品同時檢測的技術［9］。將3NT與載體蛋白的偶聯物作為免疫原，制備針對3NT的抗體，采用免疫學方法，如ELISA、Western blot、免疫組化和免疫沉淀等，為超微量檢測3NT開辟了新的途徑。該技術特異性強，靈敏度高，簡單快速，且成本低廉，樣品不需要前處理，可同時測定大量的實驗與對照組樣品，被廣泛應用于生物、化工、醫學、環境、農業等領域［10］。本研究采用戊二醛法，將3NT與卵白蛋白進行偶聯，再用紫外掃描法和聚丙烯酰胺電泳法對其進行鑒定，用BCA法測定二者結合物的質量體積分數，并測得結合物的偶聯率，免疫小鼠，獲得效價高且敏感的抗3NT抗體，為建立特異性的檢測3NT的酶聯免疫吸附法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

3NT合成于北京中科亞光生物科技有限公司;戊二醛購自SIGMA-ALORICH公司;卵白蛋白(OVA)購自Thermo公司;GelCode Blue Stain Reagent染色液、0.2% 溴酚藍、10%TEMED、低分子量蛋白標準購自BIO－RAD;BCA試劑盒購自pierce公司;其余試劑為分析純。實驗動物為SPF級6周齡雌性BALB/C小鼠;紫外分光光度計、SDSPAGE電泳儀、酶標儀由北歐生物科技(北京)有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫抗原的制備(戊二醛法)

① 取 600 μL OVA(5 mg/mL)與 1.5 mL 3NT(2mg/mL)溶液混勻，于4℃冷卻。② 加21 μL 25%戊二醛，于4℃下反應2 h。③ 室溫下加入事先配制好的 0.4 M 乙醇胺(0.5M NaCO3)106 μL，2 h后終止反應。④將反應液在1×PBS緩沖液中透析，至少進行5次換液。取出3NT與OVA的結合物溶液，于－20℃冰箱冷藏保存。

1.2.2 免疫抗原的鑒定

①紫外分光光度法:采用透析用PBS調零，同時設有OVA、3NT對照，對經透析后的3NT與OVA結合物在190～350 nm的波長下進行紫外掃描，通過比較載體蛋白在交聯前后的圖譜變化進行初步分析，判斷3NT是否與載體蛋白OVA偶聯。②聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS－PA GE電泳)［11－12］:其中分離膠的體積分數為 12% ，濃縮膠的體積分數為5%。③ 偶聯率的測定:卵白蛋白含量測定用BCA法，具體步驟見文獻［13］，用酶標儀測定吸光度。測出標準曲線，再對結合物與OVA在波長280 nm處吸光度的差值進行計算，其中3NT在PBS中的摩爾消光系數ε=A(280)/CL=8 100 cm－1M－1。

1.2.3 多抗血清(pAb)的制備

用上述3NT與OVA的偶聯物免疫6周齡雌性BALB/C小鼠6只，免疫劑量每只30 μg，每只0.2 mL，皮下注射4～6點。首免時，用生理鹽水定容免疫原，與等量FCA混合，充分乳化;加強免疫時，將FCA改FIA混合，乳化，共免疫4次，每2周免疫1次，并采血，分離血清，于 －20℃保存備用。

1.2.4 抗血清的鑒定

采用上述血清進行效價測定和競爭抑制實驗。抗血清效價測定采用間接ELISA法。首先，用PBS-BTE將包被抗原稀釋到10 ng/mL，加到96孔酶標板(Streptavidin coated MTP)上，每孔100 uL，20℃溫育，并震板1 h，洗滌5次后拍干(下同);用PBS-BT將抗血清梯度濃度稀釋加到板孔中，每孔100 uL，20℃溫育1 h，洗滌;用 PBS-BT 1∶10000稀釋二抗(羊抗鼠)，每孔 100 uL，20℃ 溫育1 h，洗滌;再加入TMB底物溶液，每孔50 uL，避光溫育15 min;最后每孔加入100 uL 2mol/L的硫酸溶液終止反應，酶標儀上測定450處吸光值。其中空白對照(BC)為 PBS-BT溶液，陰性對照(NC)為小鼠免疫前所采的陰性血清。陽性孔判定:待測孔OD450值大于等于NC OD450值的2.1倍(P/N≥2.1)，陽性孔的血清最大稀釋度即為抗血清的效價［14］。

2 結果與分析

2.1 通過顏色判斷偶聯是否成功

3－硝基酪氨酸是有顏色的物質。主要是物質當中的硝基為發色團，能加深色原體的顏色，且本身呈黃色;而原載體蛋白OVA中無硝基的存在，為無色液體。本實驗在完成透析前后反應體系均呈淺黃色，說明偶聯成功。

2.2 紫外掃描

載體蛋白(OVA)、3－硝基酪氨酸和二者結合物的紫外掃描結果見圖1。

OVA在波長280 nm處有最大吸收峰，3－硝基酪氨酸在277 nm波長處有最大吸收峰，而兩者結合物的最大吸收峰在270 nm，明顯不同于載體蛋白與半抗原的吸收曲線。在抗原合成過程中，經過透析后已經基本上把反應中殘留的小分子物質從蛋白溶液中除去，而紫外圖譜顯示經透析過后的蛋白特征吸收峰明顯發生紅移，說明載體蛋白上偶聯上了3NT，證明人工抗原合成成功。

圖1 卵白蛋白、三硝基酪氨酸及二者結合物的紫外光譜

2.3 電泳

圖2顯示，OVA條帶在43KD左右，而3NT與OVA結合物的條帶明顯比43KD大，且成一區域性條帶，進一步說明偶聯成功。

圖2 3NT與OVA結合物的SDS-PAGE電泳圖

2.4 標準曲線

卵白蛋白含量測定的標準曲線如圖3所示。

圖3 標準曲線

由標準曲線可得 A=0.16，B=0.001 52。結合物的兩復孔值分別為OD1=1.437，OD2=1.454。代入公式C=(OD－A)/B得到稀釋過的結合物溶液的蛋白質濃度C=0.847 mg/mL，而結合物溶液的蛋白質濃度為0.847 ×2=1.69 mg/mL，為計算3NT的偶聯率提供了數據。

由紫外掃描圖譜知，A280(結合物)=1.5，A280(OVA)=0.645，而 OVA 濃度 =0.847 mg/mL，OVA摩爾分子量為43 000。代入公式

可得3－硝基酪氨酸的偶聯率為5.4。

2.5 抗血清的效價測定

由間接ELISA法測定6只小鼠血清，測得其中2只(348#與358#)抗血清的效價分別為1∶80 000與1∶27 000，結果見表1，說明被免疫的這2只小鼠產生了抗體。

表1 間接ELISA測小鼠血清效價

3 討論

本實驗采用戊二醛法將大分子量的載體蛋白OVA與小分子的半抗原3－硝基酪氨酸連接，得到完全抗原3NT-OVA結合物，紫外光譜掃描結果及SDS-PAGE電泳表明3－硝基酪氨酸偶聯成功。計算得到3－硝基酪氨酸與OVA的偶聯率為5.4，為進一步建立酶聯免疫吸附法測定人體內3－硝基酪氨酸含量提供了合適的免疫原。

用紫外分光光度法測定的半抗原與載體蛋白的偶聯數目一般比它的實際值低，可能是因為本實驗所測3－硝基酪氨酸的偶聯數目是在假定其在波長280 nm的摩爾消光系數和3NT-OVA結合物在同一波長的摩爾消光系數相同的前提下計算出來。且在用紫外分光光度法掃描時，最初發現蛋白與結合物在20 μg/mL的濃度下掃描時，二者波峰均不明顯，甚至未出現波峰，產生原因可能是濃度太低，紫外無法掃描，增大濃度即可改變此現象。

綜上所述，本研究成功合成了3NT人工抗原，免疫BALB/C小鼠后制備出高效價、敏感的pAb，為抗3NT單克隆抗體(mAb)的進一步研制、免疫學分析方法的建立奠定了基礎。

［1］Ryberg H，Caidah L K.Analyt Techno l Biomed Life Sci［J］.J Chromatogr B，2007，851(1/2):160 －171.

［2］Crow J P，Ischiropoulos H.Detection and quantification of nitrotyrosine residues in proteins:In vivo marker of peroxynitrite［J］.Meth Enzymol，1996，269:185 － 194.

［3］Halliwell B.What nitrates tyrosine Is nitrotyrosine specific as a biomarker of peroxynitrite formation in vivo［J］.FEBS Lett，1997，411:157 －160.

［4］付彩芳，高秀杰.高效液相色譜法測定阿奇霉素顆粒的含量［J］.臨床醫藥實踐雜志，2008(19):1020－1022.

［5］胡陽，倪輝，吳光斌，等.高效液相色譜法測定乳制品中三聚氰胺的含量［J］.集美大學學報:自然科學版，2010(1):36－38.

［6］劉成紅.高效液相色譜法測定生乳靈中哈巴俄苷［J］.中國新藥雜志，2011(2):184－186.

［7］Shigenaga M K，Lee H H，Blount B C，et al.Inflammation and NOX-induced nitration:Assay for 3-nitrotyrosine by HPLC with electrochemical detection［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94:3211 －3216.

［8］Greenacre S A B，Ischiropoulos H.Tyrosine nitration:localization，quantification，consequences for protein function and signal transduction［J］.Free Rad Res，2001，34:541－581.

［9］高宏斌，許艇，李季.免疫分析方法在擬除蟲菊酯類農藥殘留檢測中的應用進展［J］.農業環境科學學報，2006，25(z):425 －428.

［10］周培，陸貽通.農藥殘留的酶聯免疫檢測技術研究進展［J］.農藥，2002，41(3):9 －11.

［11］何鐘佩.農作物化學控制實驗指導［M］.北京:北京農業大學出版社，1993:60－68.

［12］RENSON C，DEGAND G，MAGHUIN － ROGISTER G.Determination of sulpham ethazine in animal tissues by enzyme immunoassay［J］.Analytica Chimica Acta，1993，275:323－328.

［13］Bainor A，Chang L，McQuade T J.Bicinchoninic acid(BCA)assay in low volume［J］.Analyltical Biochem，2011，410(2):310.

［14］劉媛，劉賢進，于向陽.玉米赤霉醇人工抗原合成及其多克隆抗體的制備［J］.分析科學學報，2006，22(1):1－4.