芹菜籽提取物誘導卵巢癌SKOV-3細胞凋亡的實驗研究

張 偉 李福榮

(泰山醫學院，山東 泰安 271000)

芹菜籽含有豐富的營養元素以及多種具生理活性的物質，主要包括揮發油化合物、不飽和脂肪酸、類黃酮物質、丁基苯酞類、氨基酸、膳食纖維、香豆素衍生物等多種物質。芹菜籽具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂等多種藥理活性，它的提取物對已孕或未孕子宮具有收縮作用，可以治療痛經［1］，在澳洲，芹菜籽油還被用于治療關節疼痛。芹菜籽作為一種具有良好發展前景的抗腫瘤藥物，已受到研究者的廣泛關注，但對卵巢癌細胞的影響及分子機制尚未見報道。本課題就芹菜籽提取物對卵巢癌細胞的凋亡作用進行了實驗研究，旨在為芹菜素應用于卵巢癌的臨床治療提供實驗資料和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌細胞SKOV-3購于中科院上海細胞所，培養瓶，培養板(costar公司)，RPMI-1640細胞培養液(Gibic公司)，10%新生牛血清(杭州四季青公司)，ECL化學發光試劑盒(美國promega公司)，硝酸纖維素膜(英國Buckinghamshire，Amersham公司)

1.2 方法

1.2.1 CO2超臨界萃取法(SFE--CO2)提取芹菜籽粗提物取經烘干、粉碎、過篩(60目)的芹菜籽350 g，SFE流程:CO2鋼瓶→冷凍系統→高壓泵→萃取釜→解析釜Ⅰ→解析釜Ⅱ→冷凍系統(循環)。萃取物為半固體油狀物，顏色為深褐色，得到量為98 g。

1.2.2 對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)消除率的測定用70%乙醇配制濃度分別為不同濃度的芹菜籽提取液混合物溶液2.5 ml。配制0.2 mmol/L的DPPH溶液。取500 μL樣液加入2 ml 0.2mmol/L的DPPH溶液和1.5 ml 70%乙醇，搖勻后水浴30 min，以70%乙醇溶液作對照，分別測定517 nm處的吸光值A。同時測定樣本溶液500 μL與3.5mL70%乙醇溶液混合后517nm處的吸光值A0，再測定2 ml DPPH溶液與2 ml 70%乙醇混合液在517nm處的吸光值A1，所有測定平行進行三次，取平均值。

按下式計算其清除率［2］:

清除率(%)=［1-(A-A0)/A1］×100

1.2.3 細胞培養 將卵巢癌SKOV-3細胞置于含有10% 胎牛血清的RPMI 1640培養基，37℃、體積分數0.05%CO2飽和濕度的培養箱中無菌培養，待細胞匯合度達80～90% 時，以0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期細胞進行以下實驗。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察實驗各組藥物對凋亡的影響 制備細胞爬片，終濃度為0.05、0.5、5 μg/L的芹菜籽提取物作用12h。室溫下4%多聚甲醛固定20 min。每片蓋玻片加Annexin-V FITC和碘化丙啶(PI)染色封片，立即在488 nm波長下用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態。

1.2.5 Western blot檢測Caspase-3蛋白的表達

設空白對照組及 0.05，0.5，5 μg·/L CSE 處理組。收獲處理12 h后的各組細胞，用RIPA液裂解提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。取40 μg總蛋白選擇12%分離膠和5%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，完畢后將蛋白質電轉印至PVDF膜。5%脫脂奶粉的TBST封閉4 h后分別加1∶500稀釋的兔抗人Caspase-3多克隆抗體，4℃ 孵育過夜，TBST洗滌3次，再加1∶1000稀釋的FITC標記的山羊抗兔IgG溫育2 h，TBST洗3次，進行顯影。用Image-Pro Plus-Version 6.0 for windowsTM圖像處理系統分析目標條帶的灰度值，以表示Caspase-3蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 DPPH消除率的測定

DPPH是一種非常穩定、可以長時間保存的自由基，經常被用來作為測試抗氧化性試劑。當它遇到能釋放質子的物質或者被還原時，自由基被消除，化合物溶液顏色發生顯著變化，溶液從紫色脫至淡黃色。加入樣品后，在517nm處測定其吸光度的變化，可求得樣品對DPPH的消除率。結果表示芹菜籽提取物具有較強的抗氧化能力，并且在一定范圍內具有一定的濃度依賴性。見表1。

表1 芹菜籽提取物對DPPH的清除率

圖1 激光共聚焦顯微鏡檢測CSE對SKOV-3細胞凋亡的形態學改變

2.2 CSE對SKOV-3細胞凋亡的作用

經0.05、0.5、5 μg/L CSE 處理12 h 后，激光共聚焦顯微鏡觀察到，在損傷組早期以及晚期凋亡細胞數均較多，早期凋亡的形態學表現為細胞膜著綠色，晚期則表現為細胞核著色，或者紅色細胞核濃染固縮并將游移出細胞，即典型的凋亡小體表現。另有較多的細胞主要呈現紅色的細胞核，細胞膜破碎甚至而不見細胞膜，呈現晚期凋亡典型的形態學表現。見圖1。

2.3 CSE對SKOV-3細胞Caspase-3蛋白表達的影響

經0.05、0.5、5?g/L CSE 作用12h后，采用Western blot檢測各組細胞中Caspase-3蛋白表達，可見各組細胞中內參蛋白β-actin條帶亮度相似，在32 kD位置均出現Caspase-3特異性蛋白條帶，但經過CSE處理后，Caspase-3蛋白條帶表達明顯增加(P＜0.05)。見圖2。

圖2 CSE對SKOV-3細胞Caspase-3蛋白表達的影響

3 討論

自由基在生物體衰老與疾病以及正常的免疫、代謝與細胞信號傳導等過程中都起著重要的生理作用，有機體的許多病理生理現象如衰老、動脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷都與自由基對機體的氧化損傷有關，因此尋找能夠清除自由基的抗氧化劑就顯得十分重要，此外清除自由基作用可能也是芹菜籽具有抗腫瘤活性和提高肌體免疫能力的一個因素。

中草藥中含有豐富的自由基清除成分，研究表明芹菜籽提取物還具有一定的抗氧化性，芹菜所含豐富的黃酮類化學物具有抗氧化清除自由基的能力。Momin RA［3］從芹菜籽中得到的兩種化合物在濃度分別為125g/L、250g/L時顯示出很好的抗氧化性。其中黃酮中含有的3-正丁基苯酞和芹菜鎮靜素(Sedanolide)具有抗腫瘤的活性，可使腫瘤發生率從68%各下降至30%和11%。南京趙珺的研究表明芹菜素在25～100μg/mL范圍內能有效清除DPPH自由基和羥自由基(HO·)，減輕HO·對DNA 的損傷［4］。

在本實驗中，我們使用紫外分光光度計測定溶液吸光度，利用DPPH實驗檢測芹菜籽提取物各成分抗氧化作用的能力，結果證實芹菜籽的提取物具有較強的抗氧化能力，并且與濃度呈現一定依賴性。

應用Annexin-V聯合PI雙染色法對卵巢癌細胞染色，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，Annexin-V可以細胞膜的磷脂酰絲氨酸發生特異性結合，當細胞發生凋亡時，磷脂酰絲氨酸外露，Annexin-V可以與其結合，細胞膜呈現綠色熒光，所以可以用來檢測凋亡早期細胞;PI可以在凋亡后期進入凋亡小體，與DNA結合，細胞核呈現綠色熒光，所以可以用來檢測晚期凋亡細胞。該染色可以區分早期和晚期凋亡的細胞。

實驗結果表明，一定濃度的CSE對SKOV-3細胞作用12h就可以顯著增加細胞的凋亡，且隨著濃度的增加，CSE對SKOV-3細胞的促凋亡作用逐漸增強，呈一定的劑量依賴性。

目前大多數學者認為細胞凋亡受抑是腫瘤發生的重要原因，誘導腫瘤細胞凋亡已成為現代抗腫瘤治療的新策略。細胞凋亡受機體促凋亡調節分子如Caspase家族和抑制凋亡調節分子如凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosisproteins，IAP)等家族的調節，是一種細胞程序性的死亡過程，是機體清除衰老、損傷和突變細胞的重要方式。目前在人體內已發現Caspase家族中起核心作用的是Caspase-3［5］。同時Caspase-3活性增加是細胞凋亡的一種重要機制。因為正常情況下細胞質中的Caspase-3以無活性的procaspase-3形式存在，在多種凋亡信號刺激下經蛋白水解作用將無活性的前體procaspase-3激活成活化的Caspase-3，從而引起細胞凋亡。

實驗中我們采用 Western blot檢測發現經0.05、0.5、5 μg/L CSE 作用 12h 后，檢測到各組細胞中Caspase-3蛋白表達，處理后的 SKOV-3細胞中Caspase-3蛋白表達增加(P＜0.05)，隨著濃度增加，Caspase-3條帶亮度增加。因此我們推測芹菜籽可能通過增加Caspase-3的活性，從而誘導卵巢癌SKOV-3細胞的凋亡。

［1］ 江蘇新醫學院.中醫大辭典:上［M］.上海:上海科技出版社，1986.

［2］ 王威.黃酮類食用天然色素抗氧活性的研究［J］.食品科學，2001，22(5):262-281.

［3］ Momin R A，Nair M G.Antioxidant，cyclooxygenase and topoisomerase inhibitory compounds from Apium graveolens Linn seeds［J］.Phytomedicine，2002，9(4):312-318.

［4］ 趙珺，王麗，李磊，等.芹菜素對自由基致DNA損傷的保護作用及機制［J］.食品科學，2011，32(13).113.

［5］ Fan T J，Han L H，Cong R S，et al.Caspase family proteases and apoptosis［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2005，37(11):719-27.