慢性阻塞性肺疾病穩定期患者外周血Th17與Treg細胞表達及意義

石建邦，劉 輝，嚴 青，夏淮玲，徐曉玲

(1宣城市人民醫院，安徽宣城242000;2安徽省立醫院)

目前認為慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種由毒性氣體或異常顆粒誘發，各種炎性細胞參與的全身炎癥反應性疾病，吸煙為主要危險因素［1］。Th17細胞是近期發現的一種T細胞亞型，在慢性炎癥和自身免疫性疾病中發揮重要作用;輔助性T細胞17(Th17)與CD+4CD+25Foxp3+調節性T細胞(Treg)細胞均來源于初始T細胞，Treg細胞是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，而Th17細胞被認為是一種介導炎癥反應的重要細胞［2］，兩者在功能和分化過程中相互遏制，在正常機體內保持平衡，共同維持機體免疫平衡。為探討Th17與Treg細胞在COPD發病機制中的作用及吸煙對其表達的影響，我們于2011年9月～2012年5月進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 35例于2011年8月～2012年8月在我院體檢中心健康查體者，依據吸煙史(吸煙量≥200支/年)分為健康不吸煙組(18例，A組)健康吸煙者(27例，B組);另選44例慢性阻塞性肺疾病穩定期患者(C組)，均有吸煙史。A組與B組納入標準:①3個月內無呼吸系統疾病史且1個月內未使用任何藥物;②年齡45～75歲;③肺功能檢查正常;④無風濕免疫系統疾病、過敏性疾病及變態反應疾病;⑤簽署知情同意書。C組納入標準:①符合2007年修訂版《慢性阻塞性肺疾病診斷指南》;②年齡45～75歲;③近半年內無急性加重史;④簽署知情同意書。C組排除標準:①合并其他肺部疾病或有其他系統感染;②有風濕系統疾病或者免疫功能缺陷;③1個月內使用糖皮質激素;④有嚴重的其他系統疾病或惡性腫瘤。各組性別和年齡差異均無統計學意義，B組和C組吸煙量無統計學意義。本研究獲得醫院倫理委員會批準，并簽署知情同意書。

1.2 相關指標檢測 抽取各組清晨空腹靜脈血8 mL，3 mL置于生化管(A管)、5 mL置于肝素抗凝管(B管)。A管高速離心收集血漿置于－80℃凍存待ELISA檢測。用5 mL生理鹽水稀釋B管血液，無菌離心管中加入5 mL淋巴細胞分離液并將稀釋的血液平鋪在離心管中，室溫下2 500 r/min離心30 min，然后吸取白膜層細胞置于另一無菌離心管中，再用10 mL生理鹽水稀釋白膜細胞，2 000 r/min離心20 min(重復2次)，收集離心細胞并用 RPMI 1640培養液(含10%胎牛血清、0.1 g/L鏈霉素和0.1 U/L青霉素)制成PBMC懸液，調整PBMC密度至2×106個/mL，其中2×106個用于流式細胞術檢測Th17細胞。

1.2.1 外周血Th17與Treg細胞表達檢測 采用FACS法。分別取PBMC 2×106個(1 mL)于2個無菌流式細胞管(B1、B2)中，B1用于檢測Th17細胞，B2用于檢測Treg細胞。①Th17細胞檢測:B1管中加入 10 μL PMA(1 μg/mL)、10 μL 離子霉素(50 μg/mL)和1 mL 莫能菌素(2 μmol/mL)，混勻置培養箱中(37℃、5%CO2)培養5 h。取出細胞懸液用PBS洗滌離心，棄上清后加入5 μL抗人CD4-FITC單克隆抗體，振勻，避光孵育30 min;用2 mL固定破膜劑緩沖液洗滌2次，收集離心細胞并加入1 mL固定破膜劑工作液，4℃避光孵育30～60 min;用固定破膜劑緩沖液2 mL洗滌2次，加入5 μL PE標記的抗人IL-17抗體，振勻后置4℃避光孵育30 min;用PBS洗滌后棄上清并用1%多聚甲醛固定液(0.5 mL)固定待測;上流式細胞儀檢測，以CD4直方圖設門區分細胞，以散點圖表示IL-17+細胞，用Cellquest軟件獲取并分析檢測結果。②Treg細胞檢測:B2管中加入5 μL抗人CD4-FITC和CD25-PE單克隆抗體、振勻，避光孵育30 min;用固定破膜劑緩沖液2 mL洗滌2次，收集離心細胞并加入1 mL固定破膜劑工作液，4℃避光孵育30～60 min;用固定破膜劑緩沖液2 mL洗滌2次，加入5 μL抗人Foxp3 PE-Cy5單克隆抗體，振勻后置4℃避光孵育30 min;用PBS洗滌后棄上清并用1%多聚甲醛固定液(0.5 mL)固定待測;上流式細胞儀檢測，以 CD4、CD25設門區分細胞，再測定Foxp3+細胞。

1.2.2 外周血及PBMC培養液中IL-17水平檢測將各組PBMC(2×106個，1 mL)加入24孔培養板內，每孔1 mL RPMI 1640培養液制成的細胞懸液，予以100 μL植物凝集素(0.4 g/L)于 37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，收集上清置于－80℃凍存。取上述凍存血漿及PBMC培養上清液，采用ELISA法測定IL-17水平。嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.3 相關性分析 分析相關指標與吸煙年數及FEV1/FEV1預計值的關系。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統計學分析。計量資料用ˉx±s表示，多組均數比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗;定性資料用χ2檢驗。P≤0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血Th17與Treg細胞表達 見表1。

2.2 外周血及PBMC培養液中IL-17水平 見表2。

2.3 相關性分析 B組:外周血Th17、Treg細胞與吸煙年數均呈正相關(r=0.782，P ＜0.01;r=0.421，P=0.029)。C組:外周血Th17細胞與吸煙年數呈正相關(r=0.409，P=0.009)，Treg 細胞與吸煙年數無相關性(r=0.032，P=0.834);外周血Th17細胞百分比與FEV1/FEV1預計值無相關性(r= －0.04，P=0.979);外周血及 PBMC 刺激培養液中IL-17水平與FEV1/FEV1預計值均呈負相關(r=-0.535，P ＜0.01;r= －0.393，P=0.008)。

表1 各組外周血Th17、Treg細胞比較(%，ˉx±s)

表2 各組外周血及PBMC培養液中IL-17水平比較(pg/mL，ˉx ±s)

3 討論

研究證實，吸煙可誘導Th17細胞增殖和活化并高分泌IL-17，后者使氣道上皮細胞和內皮細胞釋放IL-6和IL-8等致炎因子和趨化因子，促使中性粒細胞和巨噬細胞募集到肺部炎癥組織并分泌彈性蛋白酶破壞肺組織［3］;IL-6可強化Th17細胞的分化，且Th17細胞自分泌的IL-21能建立一個正反饋體系，并依賴核轉錄因子STAT3與IL-21啟動子結合誘導Th17的進一步自身分化，維持微環境中Th17細胞的數量［4］。

初始CD+4T細胞在TGF-β和IL-6共同作用下分化為Th17細胞，Th17細胞通過分泌IL-17A、IL-17F、IL-21及IL-22在自身免疫性疾病和炎癥性疾病中發揮著重要作用。IL-17在宿主防御和炎性疾病中起重要作用，連接著固有免疫和適應性免疫機制，其不僅能誘導上皮細胞、成纖維母細胞及內皮細胞分泌多種炎性因子和趨化因子，還能誘導中性粒細胞和巨噬細胞的聚集和活化，釋放彈性蛋白酶、穿孔素及基質金屬蛋白酶等破壞肺組織，促使COPD的發生和發展［5］。初始CD+4T細胞在TGF-β的單獨誘導下分化為Treg細胞，且能分泌TGF-β、IL-10等細胞因子并表達Foxp3，在維護機體免疫平衡中發揮重要作用［6］。Treg按其起源可分為天然型(nTreg)、誘導型(iTreg)和Tr1細胞。Th17和Treg細胞在機體免疫和疾病發生中起著截然不同的作用。Th17細胞主要通過分泌細胞因子促進中性粒細胞的動員、募集和活化，介導促炎反應;Treg細胞的免疫抑制作用在保持機體的免疫耐受性中發揮著決定性作用，其數量及功能異常與自身免疫性疾病、慢性炎癥反應及腫瘤的發生有密切關系。

本研究B組及C組外周血及外周血刺激培養液中IL-17水平均明顯高于A組，C組又明顯高于B組，表明香煙煙霧參與了Th17細胞的活化，可上調Th17細胞的數量或功能。研究表明長期暴露于香煙煙霧的小鼠和人的肺組織內IL-17含量明顯升高［7，8］。吸煙可誘導 Th17細胞的增殖和活化并高分泌IL-17，使氣道上皮細胞和內皮細胞釋放IL-6和IL-8等致炎因子和趨化因子，促使中性粒細胞和巨噬細胞募集到肺部炎癥組織并分泌彈性蛋白酶破壞肺組織［9］。本研究 COPD穩定期患者外周血Th17和IL-17水平及PBMC培養液中IL-17水平高于健康吸煙者和健康不吸煙者，表明Th17和IL-17過度表達和功能活化可能促使了COPD的發生;Th17細胞始終參與吸煙所致的全身性異常炎癥反應，在吸煙肺功能正常者發展到COPD這一連續的炎癥反應中發揮強大的促炎作用，健康吸煙者可能處于向COPD發展的危險階段，此與相關研究結果基本一致［10，12］。本研究C組外周血Th17細胞百分比與FEV1/FEV1預計值無相關性，而外周血和PBMC培養液中IL-17水平與FEV1/FEV1預計值呈負相關，提示外周血Th17細胞百分比與氣流受限程度明顯相關，而外周血和PBMC培養液中IL-17水平與氣流受限程度有關，表明氣流受限程度不同的COPD穩定期患者中Th17細胞活性可能存在差異。本研究相關性分析表明，B、C組外周血Th17細胞均與吸煙年數有關，表明香煙煙霧參與了Th17細胞活化，可上調Th17細胞數量。

Treg細胞在體內通過抑制體內免疫炎癥反應維持機體免疫平衡，故理論上COPD患者體內Treg細胞的數量應該減少。Smyth等［13］研究提示，健康吸煙者和COPD患者肺泡灌洗液中CD+4CD+25T細胞的數量明顯高于健康不吸煙者。本研究B組和C組外周血中Treg細胞水平均明顯高于A組，C組明顯高于B組，與Maria等［10］的研究結果一致。提示在健康吸煙者逐漸發展為COPD的過程中Treg細胞逐漸失去調節功能，使得機體免疫調節功能降低;同時激活體內反饋調節系統，促使Treg細胞數量增加，與相關研究結果相符［14］。

綜上所述，COPD穩定期患者外周血Th17、Treg細胞和IL-17水平明顯升高;Th17細胞百分比與氣流受限程度無關，但細胞活性可能與氣流受限程度有關;吸煙能夠促使Th17細胞增殖和活化，從而促使Treg細胞水平升高，可能影響Treg細胞的功能。COPD中全身的異常炎癥反應在疾病開始時期即肺功能正常吸煙階段已經存在，健康吸煙者隨著全身異常炎癥反應的放大，Th17和Treg之間平衡失調，最后發展為COPD，但由于個體易感性不同，只有部分吸煙者發展為COPD。本研究為進一步研究Th17和Treg細胞在COPD發病機制中的作用提供了理論基礎和實驗數據，對COPD治療方法的選擇和療效評價有指導意義。

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