鎘脅迫下蘿卜根系蛋白質組的差異表達

章愛秀，劉曉穎，邊立娜，彭永康

（天津師范大學a.生命科學學院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

土壤中的Cd2+可以抑制植物正常的光合作用，使卡爾文循環和光合作用電子傳遞系統受阻[1]、光系統Ⅱ（PSⅡ）中許多蛋白質被抑制表達或失去活性[2]，引起植物產生亞致死損傷[3].不同于其他的重金屬，Cd2+可以通過農產品進入人類的食物鏈，導致人體的骨骼疼痛、腎臟損害甚至誘發腫瘤[4].因此，研究Cd2+對農作物生長的影響及農作物的耐Cd2+機制，對減少農作物產量損失、防止Cd2+污染農產品、減少人類因食用含Cd2+農產品而導致的疾病具有重要意義.目前對于植物在高Cd2+濃度下忍耐和適應Cd2+危害機理的研究已取得了一些進展，如Hart等[5]研究了在不同濃度的Cd2+條件下，硬粒小麥結合、吸收和轉運Cd2+的調控機制；Shah等[6]以水稻為材料，研究了水稻植株不同器官對Cd2+吸收和積累的情況；Rivera-Becerril等[7]研究了叢枝菌根在降低豌豆Cd2+危害上的作用；Ouzounidou等[8]研究了Cd2+損傷小麥葉細胞超顯微結構的機理；另外，還有一些研究證實了Cd2+會干擾植物蛋白質的合成以及其他許多代謝過程[9-12].

轉錄組學（Transcriptomics）是從整體水平上研究細胞中基因轉錄的情況及調控規律的學科，近年來一些學者利用轉錄組技術研究Cd2+脅迫條件下植物如何調控基因的表達[13-17]，探討mRNA與其指導合成的蛋白質之間的關系，取得了大量研究成果[18].蛋白質組學是在整體水平上研究細胞內蛋白質組成及其活動規律的學科，利用蛋白質組技術研究多種植物的 Cd2+危害，如水稻（Oryza sativa）[19-20]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[21-22]、黃豆（Glycine max）[23]、楊樹（Populus alba）[2]等，結果表明，Cd2+可以影響光合作用電子傳遞系統、GSH生物合成、ATP代謝等相關蛋白的差異表達.

蘿卜作為廣泛栽種的農作物之一，其耐Cd2+機理的研究相對較少，尤其是利用蛋白質組技術對此類問題進行的研究.本課題組利用該技術對蘿卜的根系全蛋白質組和根系線粒體蛋白質組進行分析，試圖了解蘿卜在Cd2+脅迫下參與抗性反應的蛋白質及其變化，探討蘿卜的Cd2+害及耐Cd2+機理.同時，此研究也為農業上利用蛋白質組技術檢測蔬菜的Cd2+害以及系統分析蔬菜的耐Cd2+機理提供一種技術手段，為蔬菜安全生產提供服務.

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養

選取飽滿、大小均一的小沙窩蘿卜（Raphanus sativus L.）種子，經質量濃度為1.0 mg/mL的HgCl2表面消毒5 min，用自來水沖洗2次，置于鋪有蒸餾水濕潤的定性濾紙的培養皿中連續培養.22℃恒溫光照條件下培養16 h后，18℃恒溫黑暗條件下繼續培養8 h.3 d后用濃度分別為10、50、100、150 μmol/L的CdCl2處理幼苗12 h（根施），切取胚根為蛋白質分析樣品，對照組樣品為未經處理的3 d幼苗胚根.

1.2 蛋白制備

1.2.1 根系全蛋白的制備

制備蛋白質樣品參照Yan等[24]的方法.在液氮中將根尖組織快速冷凍研磨，用含質量濃度0.7 mg/mL二硫蘇糖醇（DTT）的體積分數為10%的冷丙酮懸浮勻漿液，-20℃下溫育1 h.在4℃下3 500×g離心5 min，用含質量濃度0.7 mg/mL DTT的丙酮重懸離心所得的碎片沉淀，-20℃下溫育1 h，再在4℃下1 500×g離心30 min.上述步驟重復3次.樣品凍干后溶解于樣品緩沖液中[8mol/L尿素，35 mmol/L Tris，質量濃度 40 mg/mL 3-二乙胺-丙磺酸（CHAPS），體積分數為1%且pH為5～7的兩性離子，體積分數為0.4%pH3～10的兩性離子，質量濃度為10 mg/mL的DTT].樣品蛋白質含量的測定參考Bradford[25]的方法，用牛血清白蛋白（BSA）作為標準.

1.2.2 根系線粒體分離與線粒體蛋白質制備

稱取胚根30 g，剪成5～10 mm長度的碎片，加入100 mL預冷的研磨介質[0.3 mol/L甘露醇，50 mmol/L焦磷酸鈉，質量濃度為5 mg/mL的BSA，5 mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮-40（PVP40），2 mmol/L乙二醇-雙-四乙酸（EGTA），20 mmol/L半胱氨酸（Cys），pH8.0]，在細胞破碎儀上破碎均勻后，用4層無菌紗布過濾，收集濾液.濾液在4℃下1000×g離心5min，取上清液，4℃下18000×g離心15min，棄上清液.用研磨介質重懸得到的沉淀，重復一次上面2步離心過程.用甘露醇緩沖液[0.3 mol/L甘露醇，1 mg/mL BSA，10 mmol/L N-三甲基-2-氨基乙磺酸-氫氧化鈉（TES-NaOH），pH7.5]重懸得到的細胞器沉淀.預備質量濃度分別為180、230、400 mg/mL的Percoll與甘露醇緩沖液的混合液，按照上述濃度混合液的體積比為2∶4∶1在離心管中自上向下排列.將重懸液鋪在離心管中Percoll的不連續梯度混合液上，4℃下40 000×g離心45 min，吸出在230和400 mg/mL Percoll的分界處出現的不透明條帶，該條帶即為線粒體條帶.4℃下15 000×g離心15 min，沉淀即為濃縮的線粒體.

用甘露醇緩沖液重懸之后，鋪在自形成的Percoll梯度緩沖液上，即含280 mg/mL Percoll的蔗糖緩沖液[0.3 mol/L蔗糖，1 mg/mL BSA，10 mmol/L TES-NaOH，pH7.5]上，4℃下40000×g離心30min.在Percoll梯度的頂端形成線粒體條帶，Percoll梯度底端形成的條帶則為過氧化物酶物質.吸出線粒體條帶，4℃下15 000×g離心15 min.

用甘露醇緩沖液重懸沉淀，4℃下15 000×g再次離心15 min.重復上一步，即可得到較純的線粒體沉淀.將丙酮加入到線粒體樣品中至最終體積分數為80%，抽提蛋白質，-20℃下放置4 h.4℃下20 000×g離心15 min后，用等電聚焦裂解液[6 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，20 mg/mL CHAPS，體積分數2%兩性電解質，2 mmol/L三丁膦，0.01 mg/mL溴酚藍]重懸沉淀，置于冰上2 h.

1.3 雙向凝膠電泳（2-DE）分析

蛋白質的雙向凝膠電泳（2-DE）分析參閱Castro等[26]的方法進行.使用長度為13 cm的pH3～10的固相化pH梯度（IPG）膠條，操作步驟參照Bio-Rad產品說明書.取待測蛋白樣品60 μg，用樣品緩沖液稀釋至300 μL，將干的IPG膠條放在含待測樣品的緩沖液中，300 V下水化10 h，使待測樣品吸入到膠條中.第一向等電聚焦參數設定如下：300 V下1 h，1 000 V下1 h，8 000 V下2 h.等電聚焦結束后將膠條放在膠條平衡液中[60 mmol/L Tris-HCl，pH6.8，10 mg/mL DDT，10 mg/mL甘氨酸，20 mg/mL十二烷基硫酸鈉（SDS）]平衡20 min.第二向12.5%（質量分數）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）參考Laemmli[27]的方法進行.將等電聚焦后的膠條放在第二向凝膠的上面，用含0.15 mol/L Bis-Tris、0.1 mol/L HCl和2 mg/mL SDS的10 mg/mL瓊脂糖封膠，凝固后在80 V下電泳5 h，結果重復3次.采用銀染法[28]染色顯現結果.用GS-800考馬斯亮藍對MS分析膠染色，色譜掃描儀記錄圖像，用PDQuest軟件檢測、匹配和鑒別分析凝膠斑點，找出對照組材料和處理組材料之間有差異的蛋白質斑點，進行基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）分析.

1.4 凝膠消化和MALDI-TOF-MS分析

把經鑒別有差別的目標蛋白質斑點從制備膠上切下，超純水洗3次，用50 mmol/L NH4HCO3脫色2次，經體積分數為100%的乙腈干燥后，在體積分數為50%的乙腈溶液中，用體積分數為0.1%三氟乙酸（TFA）37℃下孵育過夜，混勻、凍干制備物，用含有體積分數為1%的TFA和體積分數為50%的α-氰基-4-羥基肉桂酸溶液溶解制備物等待檢測.利用ABI4700型（美國）正離子生物質譜儀進行MALDI-TOF MS分析，胰蛋白酶自動降解片段為內部標準校正.使用MASCOT軟件在NCBInr綠色植物數據庫（Viridiplantae）上進行查詢，明確其歸屬.

2 結果與分析

利用2-DE技術，分析蘿卜幼苗經10、50、100和150 μmol/L Cd2+處理12 h后胚根中全蛋白質組和線粒體蛋白質組的情況.結果表明，經10 μmol/L Cd2+誘導后胚根中的蛋白質組沒有產生變化；在濃度為50 μmol/L Cd2+下，蛋白質斑點包括全蛋白質組和線粒體蛋白質組開始出現變化，主要表現在蛋白質的含量上，即部分蛋白質的表達產生上調、下調現象，幾乎沒有出現新誘導的蛋白質斑點或某些蛋白質斑點的抑制表達現象，如表1所示；但在100 μmol/L時，胚根中的全蛋白質組和線粒體蛋白質組均有明顯變化，統計結果表明，共有44個蛋白質斑點產生變化，其中新誘導蛋白質斑點1個，抑制表達蛋白質斑點7個，上調6個，下調30個，與處理濃度50 μmol/L Cd2+相比，出現了個別蛋白質斑點的誘導形成和部分原有蛋白質斑點抑制合成的現象；Cd2+濃度150 μmol/L下處理蘿卜幼苗，其全蛋白質組和線粒體蛋白質組的變化與Cd2+濃度100 μmol/L下的處理結果類似.

表1 不同濃度Cd2+處理12 h后蘿卜幼苗胚根蛋白質組變化Tab.1 Changes in root proteomic of radish seedlings treated with different concentration of Cd2+for 12 h

2.1 胚根全蛋白質組

利用2-DE技術，新得到的胚根全蛋白質組譜型見圖1，第一向水平軸表示的是等電聚焦，pH范圍是4.5～8.6，第二向為表示相對分子質量的SDSPAGE垂直膠，相對分子質量范圍為1.4×104～9.7×104（生物學表示為14～97 kDa）.圖中箭頭指的是有含量變化或新誘導出和消失的蛋白質斑點.

在對照組（0 μmol/L）和處理組（100 μmol/L）中，多于1 000個左右的蛋白質斑點被檢測到，其中有22個蛋白質斑點在與Cd2+反應中表現出差異表達現象，包括11個蛋白質斑點（斑點4、斑點9～18）下調，4個蛋白質斑點（斑點19～22）上調，7個蛋白質斑點（斑點 1～3、5～8）被抑制表達.對這 22個與Cd2+誘導相關的蛋白質進行MALDI-TOF-MS分析，結果見表2，質譜鑒別的Cd2+誘導后抑制表達的蛋白質斑點中7個蛋白質斑點的歸屬得到鑒別.表3為蛋白質含量上調和下調的蛋白質斑點，除斑點22沒有鑒別外，其余蛋白質歸屬均得到鑒別.

圖1 蘿卜幼苗經100 μmol/L CdCl2處理12 h后根系內全蛋白質組的變化Fig.1 Changes in root proteomic of radish seedlings treated with 100 μmol/L CdCl2for12 h

2.2 胚根線粒體蛋白質組

蘿卜幼苗經Cd2+誘導后，根系中超過400個線粒體蛋白質斑點被檢測到，有22個線粒體蛋白質產生變化，其中19個蛋白質（斑點1～19）下調，2個斑點（斑點20～21）上調，1個新的線粒體蛋白質斑點（斑點22）被誘導合成（圖2）.

表2 根系全蛋白質組內被抑制表達的蛋白質斑點Tab.2 Inhibition expressed proteins identified by MALDI-TOF-MS in root proteomic

表3 根系全蛋白質組內上調和下調的蛋白質斑點Tab.3 Differential expressed proteins（down-or up-regulated）identified by MALDI-TOF-MS in root proteomic

圖2 蘿卜幼苗經100 μmol/L CdCl2處理12 h后根系線粒體差異表達蛋白質組的變化Fig.2 Changes in root mitochondrial proteomic of radish seedlings treated with 100 μmol/L CdCl2for 12 h

通過質譜分析，18個線粒體蛋白質的歸屬得到鑒別，結果見表4.22個斑點中有4個斑點因所鑒別的蛋白質斑點得分偏低或實驗所得到的蛋白質相對分子質量小、pI與理論值偏差高而未能鑒別.

表4 上調和下調的線粒體蛋白質斑點Tab.4 Differential expressed mitochondrial proteins（down-or up-regulated）identified by MALDI-TOF-MS

3 討論

利用蛋白質組技術研究作物的Cd2+害及耐Cd2+機理已有很多報道.在水稻中，Cd2+可以影響正常的光合作用，損壞與光合作用相關的蛋白，如RUBisco；100 μmol/L Cd2+可以誘導一些調控蛋白如ERI類受體蛋白激酶、細胞分裂素氧化酶以及一些與代謝相關的酶，如肉桂醇脫氫酶[24].在擬南芥中，發現Cd2+能激活碳、氮和硫代謝，促使合成一些螯合分子，如植物螯合肽（phytochelatin PC）或它的前體GSH[26].在楊樹中發現Cd2+會嚴重影響卡爾文循環和光合作用電子傳遞系統[2]，多種與此相關的蛋白質表達豐度減少.在綠藻中也得出與楊樹相同的實驗結果.這些研究為了解植物的Cd2+害及耐Cd2+機理提供了很多幫助，為生產上減少Cd2+害造成的損失也有一定意義.但此類研究針對葉片蛋白質組方面偏多，而直接接觸Cd2+害的組織胚根蛋白質組則相對較少.

本研究以沙窩蘿卜為材料，研究了不同Cd2+濃度（10、50、100、150 μmol/L）處理 12 h后，蘿卜根系中蛋白質組的變化.結果表明，根系全蛋白質組中約有1000多個蛋白質斑點、根系線粒體蛋白質組中約有400多個蛋白質斑點被檢測到.Cd2+濃度小于50 μmol/L時，不足以引起上述2種蛋白質組的變化；在Cd2+濃度為50 μmol/L時，均發現根系全蛋白和線粒體蛋白質組有部分蛋白表達豐度上的變化；變化最明顯的是Cd2+濃度達到100 μmol/L時，根系的蛋白質組中有7種蛋白質被抑制表達，從新鑒別的蛋白質功能歸屬上，有負責種子發芽、幼苗生長貯藏營養的cruciferin（斑點1）、行使基因中內含子剪接的maturase K（斑點2）、負責DNA合成（斑點3）、不良環境抗御（斑點5）、基因轉錄（斑點8）、信號轉導（斑點6）以及細胞結構維持（斑點7）等相關蛋白.根系中除了抑制表達的8種蛋白之外，至少還有14種蛋白質的表達量產生明顯變化，從所鑒別的功能看，這些產生上調或下調的蛋白質，其基本功能涉及基因轉座、RNA合成、蛋白質剪切與折疊、能量代謝等.根系線粒體蛋白質組檢測結果表明，有15種位于線粒體中的蛋白質的表達豐度發生變化，這些變化的線粒體蛋白質除有2種蛋白質的歸屬未被鑒別外，其余13種線粒體蛋白質中，有 6種蛋白質（斑點 1、3、5、9、12、13）與能量代謝相關.

本研究通過蛋白質組技術，分析蘿卜幼苗根系對Cd2+脅迫的反應，得到的初步實驗結果有2個方面：（1）50 μmol/L Cd2+開始引起蘿卜根系蛋白質組的變化，Cd2+濃度為100 μmol/L時有多種蛋白質丟失和表達豐度上產生變化，從蛋白質組角度可以認為，50～100 μmol/L是蘿卜對Cd2+反應的臨界劑量；（2）蛋白質組技術不僅可以了解蘿卜在Cd2+誘導下體內轉譯水平上蛋白質組的變化，也可以解釋轉譯后修飾的蛋白質組變化的信息，藉此可以全面了解植物Cd2+害及耐Cd2+機理.

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