抗白粉病小麥近等基因系DNA甲基化的MSAP分析

孫中潔，王振英，潘麗娜

（天津師范大學a.生命科學學院，b.天津市動植物抗性重點實驗室天津300387）

小麥白粉病是由禾布氏白粉菌（Blumeria graminis（DC）.Speer f.sp.tritici）引起的一種世界性病害，它直接影響小麥的高產、穩產，是小麥的主要病害之一[1].目前防治小麥白粉病的工作主要集中在兩方面，即新抗病基因的發掘和新型抗病品系的選育[2-4]，而對白粉菌脅迫應答的生理機制研究較少，表觀遺傳修飾尤其是DNA甲基化在白粉病抗性應答中的作用研究更是缺乏.

表觀遺傳是指在DNA序列不變的情況下，可遺傳的基因表達的改變[5-6].可逆的表觀遺傳修飾能有效避免不必要的基因重組，在調控基因表達的同時維持基因組的穩定性，對于植物的生長、發育、器官分化及其對環境脅迫的適應性具有關鍵作用[7-9].其中，DNA甲基化是一種最保守的表觀遺傳修飾，指在DNA甲基轉移酶（Dnmt）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，將甲基基團轉移到胞嘧啶和鳥嘌呤（CpG）二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子上[5，10].脊椎動物中約有3%～8%基因組DNA的胞嘧啶處于甲基化狀態，而在高等植物中約有5%～30%的胞嘧啶是甲基化的[11].DNA甲基化可形成一種封閉的染色質結構，抑制基因轉錄.對擬南芥全基因組甲基化圖譜的分析表明，DNA甲基化在轉座子和基因編碼區的分布不同，轉座子及異染色質區域的基因處于高甲基化狀態，約1/3基因的編碼區是甲基化的，但它們的啟動子區很少發生甲基化修飾[12-14].

本課題組以抗白粉病代換系6A/6V及其與京411的近等基因系（NILs）為實驗材料，通過甲基化特異性片段長度的多態性（MSAP）分析其DNA甲基化模式的變化情況，為進一步闡明表觀遺傳尤其是DNA甲基化修飾在小麥白粉菌脅迫應答中的作用奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

感病品系京411由中國農業大學楊作民教授惠贈；抗白粉病代換系6A/6V由南京農業大學提供；抗病近等基因系NILs是以京411為母本，與6A/6V雜交得F1代，在F1代中選取抗白粉病植株，再以京411為父本，回交7代，再自交1代后獲得.

H/M-adapter I接頭、H/M-adapter II接頭、EcoRI-adapter I接頭、EcoRI-adapter II接頭、H/M+0引物、EcoRI+A引物、8個H/M+3引物及9個E+3引物均在上海生工生物工程有限公司合成；限制性內切酶HpaⅡ、MspⅠ及EcoR I購自NEB公司；DNA聚合酶、T4連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司.

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

取同一生長時期的0.1～0.2 g小麥葉片，采用CTAB法提取基因組DNA，利用Nanodrop微量紫外分光光度計（Nanodrop科技有限責任公司）和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取的濃度及質量.

1.2.2 甲基化敏感限制性內切酶酶切與連接

分別采用EcoR I/Hpa II和EcoR I/Msp I酶切基因組DNA，酶切體系如下：EcoR I 5 U，Hpa II（Msp I）5 U，10×Buffer 2.5 μL，基因組 DNA 500 ng，加水至25 μL.上述溶液混勻，37℃水浴酶切2 h后，80℃溫浴20 min，使內切酶失活.

接頭引物各3 μL，經95℃、5 min變性后，溫度遞降至室溫.按如下體系進行連接：10×T4連接酶Buffer 2 μL，T4連接酶 0.1 μL，E 接頭（5 μmol/L）1 μL，H（或 M）接頭（50 μmol/L）1 μL，酶切產物5 μL，加水至20 μL.20℃水浴連接過夜，然后65℃溫浴20 min，使連接酶失活.

1.2.3 預擴增

反應體系如下：Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，10×Buffer 2 μL，連接產物 2 μL，E0 引物（50 ng/μL）0.6 μL，M0/H0引物（50 ng/μL）0.6 μL，加水至 20 μL.將上述溶液混勻，采用以下反應程序進行預擴增：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環后，72℃延伸10 min.利用質量分數為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取200～1 000 bp呈彌散狀分布的產物，根據電泳亮度稀釋后進行選擇性擴增.

1.2.4 選擇性擴增

反應體系如下：Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，10 × buffer 2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，預擴增稀釋樣品 2 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，加水至25 μL.混合上述溶液，采用如下體系進行選擇性擴增：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，65℃每個循環遞降0.7℃，退火30 s，72℃延伸1 min，13個循環，隨后56℃退火30 s，72℃延伸1 min，23個循環后，72℃延伸10 min.擴增后，樣品中加入7 μL loading buffer（質量分數為98%的去離子甲酰胺；10 mmol/L EDTA，pH8.0；質量分數為0.25%的溴酚藍；質量分數為0.25%的二甲苯青）.95℃變性5 min，立即置于冰水混合物中準備進行聚丙烯酰胺凝膠電泳.

1.2.5 聚丙烯酰胺電泳及銀染顯帶

采用質量分數為6%的聚丙烯酰胺凝膠，以1×TBE為電泳緩沖液，恒功率65 W，預電泳約30 min，加選擇性擴增樣品7 μL，待電泳至第1條指示帶到達膠板的另一前沿停止，電泳90～120 min分離選擇性擴增產物.

電泳后將凝膠放入1 L質量分數為10%的冰乙酸溶液中，輕搖至指示劑無色，約25 min，再用1 L水洗膠板2次，每次5 min.水洗后把膠板放入銀染液（1 g AgNO3，1.5 mL質量分數為37%的甲醛，1 L水），輕搖約30 min.用蒸餾水快速水洗膠板5 s后放入1 L預冷的顯影液中（30 g無水碳酸鈉，1.5 mL質量分數為37%的甲醛，200 μL 10 mg/mL的硫代硫酸鈉）中迅速搖動，直至條帶出現.最后，用1 L質量分數為10%的冰乙酸溶液終止反應，約5 min后水洗，室溫下干燥.

2 結果與分析

2.1 抗病NILs及其親本京411、抗病親本6A/6V甲基化水平的變化

為研究DNA甲基化在小麥白粉病抗性應答中的作用，課題組采用MSAP法分析抗病NILs及其感病親本京411、抗病親本6A/6V甲基化水平的變化.MSAP方法是參照經典的分子標記——擴增長度多態性法（AFLP）演變而來，因此，其基本原理與AFLP大致相同.不同的是，AFLP法是將基因組DNA用2種限制性內切酶消化，而MSAP法是用一對對甲基化敏感的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ代替AFLP法中的一個限制性內切酶對基因組DNA進行消化，之后產生各種長度不一的具有黏性末端的酶切片段，接上人工接頭之后，作為PCR擴增模板，利用設計好的不同引物對其進行擴增，得到擴增產物之后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，從而產生擴增片段長度不同的電泳圖譜.這對同裂酶HpaⅡ和MspⅠ識別相同的四核苷酸位點5′-CCGG-3′序列，但是對此位點不同甲基化模式的敏感程度不同.HpaⅡ可以切割DNA單鏈上此位點的外側或內側任意一種甲基化模式，卻不可切割DNA雙鏈上此位點的外側或內側甲基化模式；而MspⅠ可以切割此序列內側胞嘧啶甲基化模式，無論此DNA是單鏈還是雙鏈，且不管此序列外側是否甲基化，只要存在內側胞嘧啶甲基化，MspⅠ均可將其切割成大小不一的片段[15].

因此，基于這一原理，用MSAP方法分析某DNA序列，經這對同裂酶酶切之后可以產生4種情況（實驗中如果出現條帶記為“+”，如果沒有出現條帶記為“－”）：①如果通過HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ酶切之后均產生條帶，即（++型），表明該序列的5′-CCGG-3′位點未發生甲基化；②如果通過HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ酶切之后均未產生條帶，即（－－型），表明雙鏈DNA的5′-CCGG-3′位點發生外部甲基化；③如果通過HpaⅡ/EcoRⅠ酶切產生條帶，而MspⅠ/EcoRⅠ酶切后沒有產生條帶，即（+－型），表明該序列發生了單鏈外側5′-CCGG-3′位點胞嘧啶的甲基化，即半甲基化；④如果通過HpaⅡ/EcoRⅠ酶切未產生條帶，而MspⅠ/EcoRⅠ酶切后產生條帶，即（－+型），表明該序列發生了雙鏈內側5′-CCGG-3′位點胞嘧啶的甲基化，即全甲基化.

如圖1所示，本實驗利用72對引物組合在NILs、京411與6A/6V基因組DNA HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ酶切產物中進行選擇性擴增共得到4 601條帶，其中NILs、京411與6A/6V中擴增得到條帶數分別為4 529條、4 482條和4 518條，3品系共有條帶4 411條，NILs與京411共有條帶63條，NILs與6A/6V共有條帶40條.

圖1 近等基因系NILs和親本京411、6A/6V中MSAP擴增條帶數Fig.1 Amount of bands amplified by MSAP in NILs and its parents Jing 411,6A/6V

進一步分析其整體甲基化水平發現，抗病近等基因系NILs整體甲基化水平（22.9%）略低于其感病輪回親本京411（23.4%），高于其父本6A/6V（21.2%），如表1所示，說明NILs的整體基因表達水平可能高于京411，低于其抗病親本6A/6V.為排除基因重組對甲基化條帶的影響，對3品系共有的4 411條帶進行整體甲基化水平分析，發現NILs的甲基化水平（21.1%）仍略低于京411（22.6%），而高于6A/6V（19.8%），如表2所示，說明抗白粉病品系的整體DNA甲基化水平低于感病品系，即相對高水平的基因表達參與了白粉病的抗性應答.

表1 近等基因系NILs和親本京411，6A/6V中MSAP擴增的條帶及甲基化率統計Tab.1 Amount of bands amplified by MSAP and the methylation rate among NILs and its parents Jing411，6A/6V

表2 近等基因系NILs和親本京411，6A/6V中MSAP擴增的共有條帶及甲基化率統計Tab.2 Shared amount of bands amplified by MSAP and the methylation rate among NILs and its parents Jing411，6A/6V

2.2 抗病NILs及其親本京411甲基化模式的變化

MSAP分析既可在整體上估測全基因組的甲基化水平，也可用于特定位點不同品系基因組的甲基化模式.如圖2所示，相對親本京411，NILs大量位點的甲基化模式發生變異，超甲基化和去甲基化均有發生.根據HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ酶切后擴增泳帶的差異，可將MSAP擴增位點分為A、B、C、D 4大類、12個亞類，如表3和圖2.其中A類NILs與京411的甲基化模式完全相同，即NILs相對京411無甲基化模式的變化.A類又可分3個亞類：A1代表HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ酶切后均有條帶；A2為HpaⅡ/EcoRⅠ酶切有條帶，而MspⅠ/EcoRⅠ酶切后無條帶擴增；A3亞類與A2相反，HpaⅡ/EcoRⅠ酶切無條帶擴增，而MspⅠ/EcoRⅠ酶切后有條帶擴增.B類NILs相對京411的甲基化水平降低，如B1、B2亞類，NILs基因組經HpaⅡ/EcoRⅠ酶切后有條帶擴增，而京411無條帶，說明該位點京411的DNA序列發生了外側的完全甲基化修飾；B3亞類中，NILs基因組經MspⅠ/EcoRⅠ酶切后有條帶擴增，而京411無條帶，說明該位點京411的DNA序列發生了內側的甲基化修飾；B4亞類中，NILs經2種酶切方式均有條帶，而京411無條帶，說明該位點發生了甲基化修飾，或者是基因重組位點.C類為NILs相對京411甲基化水平提高的位點，根據酶切擴增條帶不同可細分為4個亞類：C1、C4為京411基因組經MspⅠ/EcoRⅠ酶切后有條帶擴增，而NILs無條帶；C2、C3亞類為京411基因組經HpaⅡ/EcoRⅠ酶切后有條帶擴增，NILs無條帶.D類為甲基化模式互換條帶，NILs經HpaⅡ/EcoRⅠ酶切后有條帶擴增，而京411基因組經MspⅠ/EcoRⅠ酶切后有條帶擴增，無法判斷其甲基化模式提高還是降低.如表3所示，A類條帶占絕大多數（96.54%），說明NILs相對京411具有極其相似的遺傳背景，基因表達差異不大；B類條帶比例（2.89%）明顯高于C類（0.55%），即NILs的甲基化水平明顯低于京411，通常高甲基化抑制基因表達，說明NILs的整體基因表達水平高于京411.

圖2 部分MSAP擴增結果Fig.2 Part of MSAP result

表3 近等基因系NILs與親本京411的甲基化模式Tab.3 Model of methylation between NILs and its parent Jing411

2.3 抗病NILs及其親本6A/6V的甲基化模式的變化

根據HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ酶切后擴增泳帶的差異，也可將NILs相對親本6A/6V的MSAP擴增位點分為A、B、C、D 4大類、15個亞類，如表4所示.A類占92.52%，是NILs相對親本6A/6V甲基化模式不變的條帶；B類為NILs相對親本6A/6V甲基化水平降低的條帶；C類為NILs相對親本6A/6V甲基化水平提高的條帶；D類為NILs相對親本6A/6V發生了甲基化模式互換的條帶.如表4所示，C類（4.20%）條帶明顯高于B類（2.96%），說明NILs相對親本6A/6V甲基化水平明顯提高.

綜上，抗病NILs相對感病親本京411的甲基化水平有所降低，而相對抗病親本6A/6V甲基化水平明顯提高，說明NILs的整體基因表達水平高于京411，低于抗病親本6A/6V，即DNA甲基化水平低.基因表達相對高的品系NILs和6A/6V對白粉病有較強抗性，而整體基因表達相對低的品系京411對白粉病敏感，由此推測，DNA甲基化可能參與小麥白粉病的抗性應答.

表4 近等基因系NILs與親本6A/6V的甲基化模式Tab.4 Model of methylation between NILs and its parent 6A/6V

3 討論

植物在生長發育過程中，受到環境因子的多種脅迫刺激，如不適的溫度、壓力、水肥條件等物理性刺激，以及病蟲害等生物脅迫.為了生存與繁衍，生物體必須發展自身的耐受和適應性能，進而推動物種的進化[16-17].脅迫誘導下，植物體需要發生多種代謝反應變化以應對和適應脅迫，其中一種典型的反應就是基因組變異，但通常基因突變、重排是不可逆的，會導致物種的不穩定性.而表觀遺傳修飾的改變，可在基因序列不變的情況下，引起基因表達的變化[5，18]，并隨細胞分裂遺傳給子代，如此既賦予生物體耐受脅迫的能力，又不會造成基因的突變、重組，維持了物種的穩定[3-5].小麥白粉病是一種真菌性病害，屬于典型的生物脅迫，但目前對表觀遺傳如DNA甲基化修飾在小麥白粉病脅迫應答中的作用研究較少.

本實驗應用MSAP法分析比較抗病近等基因系NILs與其抗病父本6A/6V、感病輪回親本京411的甲基化差異.由于近等基因系在制備過程中經歷了與感病親本京411的多次回交，NILs的遺傳背景與京411極其相似，而且抗病父本代換系6A/6V的V染色體（來自簇毛麥）是獨立遺傳[19-20]，因此，可認為NILs的基因組DNA除了6V染色體與代換系6A/6V相同，其他染色體與京411相同.NILs與京411對白粉病的抗性不同可能源于6V染色體上的基因，也可能在6V染色體滲入過程中引起整體基因表達的改變.相對于京411，NILs發生DNA甲基化水平降低的條帶明顯高于甲基化水平提高的條帶，且僅B4亞類是NILs獨有的擴增條帶，可能來自6V染色體，是抗病基因.B1～B3亞類在NILs與京411中均有條帶擴增，只是相對來講，NILs擴增的條帶更多，說明外源染色體6V的滲入引起NILs整體基因組DNA甲基化水平降低，其原因可能是6V染色體上.外源抗病基因誘導下游白粉病脅迫應答通路相關基因的DNA甲基化水平降低，基因表達提高，從而對小麥白粉菌侵染產生抗性.

綜上所述，NILs與其親本京411對白粉病抗性不同很可能與它們DNA甲基化水平的差異有關，即表觀遺傳尤其是DNA甲基化參與了小麥白粉菌的脅迫應答.

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