光動力療法抑制兔耳增生性瘢痕形成的實驗研究＊

西安交通大學醫學院第二附屬醫院皮膚科 （西安710004） 王 瓊 袁景奕 王秀瑩 董穎穎 張鼎偉

增生性瘢痕（HS）是一種頑固的皮膚病，目前常用的各種治療方法并不理想，還會產生不同程度的不良反應［1，2］。光動力療法（PDT）廣泛應用于各種腫瘤性疾病和皮膚病，并且不會產生顯著的不良反應［3］。基質金屬蛋白酶（MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）對細胞、血管、組織具有復雜的調節作用。因此我們提出PDT的作用機理與調節 MMPs／TIMPs的平衡有關，擬使用不同濃度的5－氨基酮戊酸（ALA）－PDT對兔耳HS模型進行干預，觀察其對皮損外觀、組織病理的影響。同時檢測標本中 MMP－2、3、9及TIMP－1蛋白的表達和β－半乳糖苷酶（β－gal）濃度，初步探討PDT對的HS的治療作用機制。

材料與方法

1 材料與試劑

1．1 主要儀器試劑：XD－635AB型光動力激光治療儀和ALA購自中國上海復旦張江生物醫藥股份有限公司。RNA抽提試劑盒Rneasy kit購自德國Qiagen公司。熒光定量RT－PCR分析儀、SYBR green與Taq－DNA聚合酶混合試劑LightCycler均購自瑞士Roche公司。β－gal酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒購自美國santa cruz公司。

1．2 實驗動物：選擇新西蘭大耳白兔10只，雌雄不限，質量2．0－2．5kg，飼養環境22±2℃，12h晝夜循環。參照Kloeters等的方法建立兔耳HS模型［4］。

2 實驗方法

2．1 實驗分組：將形成的HS隨機分為5組，造模后第3周進行ALA－PDT干預：①20%ALA組局部使用ALA溶液濃度236mg／ml；②10%ALA組使用溶液濃度118mg／ml；③直接照射組（Dr）不使用ALA溶液；④無任何處理的陰性對照組（Neg）；⑤選取陰性對照組兔耳正常皮膚組織作為正常對照組（Nor）。具體方法：用配好的ALA藥液浸濕醫用藥棉，覆蓋于創面，封包3h后進行激光照射，設置為光斑1．0cm，時間20min，能量密度114．6J／cm2。于瘢痕形成后每周處理1次，總共4次。于治療結束后60d觀察各組瘢痕形態。

2．2 Masson膠原染色：根據Masson’s三色染色試劑盒操作說明，組織切片用二甲苯去石蠟，梯度乙醇水化，在Weigert＇s蘇木紫工作液中染色10min，品紅溶液染色5min，置于1% 磷酸鹽溶液中浸5min后將切片移至甲苯胺藍溶液染色5min，漂洗、脫水、清潔、包埋，膠原纖維被染成藍色。

2．3 RT－PCR 測 MMP／TIMP mRNA：使 用Rneasy kit試劑盒進行組織總RNA的抽提，用Taq－Man逆轉錄試劑進行RT－PCR，利用熒光定量RTPCR分析儀LightCycler和SYBR green與Taq－DNA聚合酶混合試劑對 MMP－2、3、9、TIMP－1和 GAPDH的mRNA起始量進行分析比對，從溶解曲線可以確定Ct值和樣本中最初的mRNA拷貝數。結果數據以所檢測的mRNA拷貝數／GAPDH mRNA拷貝數的相對值表示。

2．4 ELISA法測β－gal濃度：皮膚組織勻漿離心取上清，按ELISA試劑盒說明書操作，用450nm酶標儀檢測并生成標準曲線，根據標準曲線得出最終結果。

3 統計學方法 應用SPSS 13．0統計軟件包作數據處理，所有數據以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用ANOVA方差分析。

結 果

1 外觀形態變化：兔耳創面上皮化后局部形成高出于周圍正常組織的瘢痕，共造80個創面，術后3周最終形成78處HS模型，選取其中72處作為實驗觀察對象。在PDT治療4次后，瘢痕組織開始出現軟化、變平，增生塊顏色逐漸變淡。治療后60d，瘢痕明顯軟化，顏色和質地均接近正常皮膚。20%ALA組較10%ALA組為好，10%ALA組較Dr組為好。

2 Masson膠原染色：陰性對照組兔耳HS（圖1 E）與正常皮膚組織（圖1A）比較可見大量藍染較深的膠原纖維，增厚密集，外形粗大，排列雜亂無章。治療后60d的HS雖然也可見藍染的膠原纖維，但較治療前藍染變淺且纖細，膠原纖維數量減少，排列疏散并趨于一致，并且改善程度20%ALA組（圖1B）＞10%ALA組（圖1C）＞Dr組（圖1D）。20%ALA組的組織病理形態已接近正常對照。

圖1 各組膠原纖維 Masson染色（光鏡×400）A：正常對照組，B：20%ALA組，C：10%ALA組，D：Dr組，E：陰性對照組

圖2 熒光定量RT－PCR檢測 MMP／TIMP mRNA結果（與陰性對照組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001）

圖3 ELISA法檢測β－gal濃度結果（與陰性對照組比較＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001）

3 RT－PCR測 MMP／TIMP mRNA：RT－PCR結果顯示 MMP－2、3、9和 TIMP－1在正常皮膚組織中的mRNA表達量均較少。陰性對照組MMPs mRNA表達受抑制，低于正常，經PDT治療后升高，20%ALA組＞10%ALA組＞Dr組。陰性對照組TIMP－1mRNA呈強表達，經治療后降低，20%ALA組＜10%ALA組＜Dr組。GAPDH mRNA在各組的表達無顯著差異（圖2）。

4 ELISA法測β－gal濃度：所有PDT治療組的βgal濃度水平顯著高于陰性對照組，其中20%ALA組＞10%ALA組＞Dr組，并且20%ALA組水平接近于正常對照組（圖3）。表明PDT可促進成纖維細胞的老化。

討 論

機體內的細胞衰老是一種重要的抗腫瘤防衛機制，創傷修復過程中老化型成纖維細胞在控制其增殖和膠原合成方面起著重要的作用，是瘢痕形成的重要抑制因素［5］。我們以往在培養成纖維細胞過程中也發現復制老化的成纖維細胞I、Ⅲ型膠原合成量減少［6］。病理性瘢痕現有的手術切除、放療等治療方法無法誘導病變部位發生足夠量的細胞老化，同時還會引起細胞凋亡或壞死，死亡的細胞又會誘發新一輪的增殖修復，造成了臨床療效差且復發率高。因此，如果使成纖維細胞提前進入衰老階段，控制其細胞增殖及膠原合成，將有可能從根本上改變各種病理性瘢痕的發展。

研究發現MMPs／TIMPs在HS組織及光老化皮膚中的表達明顯異于正常皮膚，MMP1、MMP2、MMP3和MMP9的聯合作用可以降解大部分真皮ECM［7～9］，而 TIMP1 主 要 抑 制 MMP1、MMP3 和MMP9［10］。我們的研究中，陰性對照組兔耳 MMPs表達最低，TIMP1表達最高，表明在兔耳的HS組織中細胞老化受到抑制，給予PDT后的各組兔耳MMPs表達明顯升高、活性增強，同時TIMP1表達和活性降低，表示應用PDT可誘導瘢痕形成過程中的MMPs／TIMPs比例發生變化，促進成纖維細胞老化，從而顯著降低膠原蛋白和ECM的合成、抑制HS形成。

本實驗中對兔耳HS模型形成的早期（術后第3周）即開始進行PDT治療，使用較高濃度ALA治療4次后效果非常滿意，目前很多應用PDT治療瘢痕的研究也表明對此類患者早期治療的療效更佳［11］。另外，由于PDT的無創性，并且對新愈合的創面也無明顯刺激和毒副作用，因此我們建議對HS患者在發病早期進行PDT治療，并且適當增加光敏劑的濃度以達到更好的療效。另外PDT治療各種病理性瘢痕還具有以下優勢：①PDT組織選擇性好、作用于光敏藥物局部、毒性低、創傷小，可最大程度的保護容貌及重要器官功能。②病理性瘢痕形成過程中增殖旺盛的成纖維細胞功能活躍，這些細胞較普通細胞可以攝取并儲蓄更多的光敏劑。本研究為PDT治療病理性瘢痕提供了理論支持和依據，并對病理性瘢痕的治療提供新的思路。

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