核因子－κB在急性百草枯中毒大鼠腎臟中的表達及其意義

陜西省人民醫(yī)院西院二病區(qū)（西安710068） 時 曄 樊英華 尚 亮 劉延梅 苗 青 高 路

百草枯（Paraquat，PQ）是一種常用的廣譜除草劑，在世界范圍內(nèi)廣泛使用［1］，對人和動物有較強的毒性，其發(fā)病機制未完全闡明，也無特效解毒藥物，臨床治療效果差，病死率高達60%～80%，嚴(yán)重危害著人們的生命健康［2］。

近年研究發(fā)現(xiàn)PQ進入機體后，不僅通過自由基的脂質(zhì)過氧化機制引起組織損傷，還引起炎癥介質(zhì)和炎性因子的釋放，進－步加重組織損傷。核因子－κB（Nuclear factor kappa B，NF－κB）是調(diào)節(jié)多種細胞因子和炎性介質(zhì)表達最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo)腫瘤壞死因子－α（TNF－α）等炎性因子生成。有研究發(fā)現(xiàn) NF－κB在全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）及多臟器功能衰竭等疾病病理生理方面的重要作用，適當(dāng)抑制NF－κB的活化，能夠下調(diào)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，改善上述疾病過程中引起的機體損傷和器官功能衰竭［3］。NF－κB是否調(diào)控炎性因子參與急性PQ中毒腎組織損害，國內(nèi)目前少見報道。

材料與方法

1 動物分組及模型制備 選擇6周齡健康清潔SD大鼠60只，雄雌各半，體重150～200g（172±15g），購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。隨機分三組，每組20只。

對照組（A組）：1ml生理鹽水腹腔內(nèi)注射；低劑量染毒組（B組）：按15mg／kg將PQ稀釋后腹腔內(nèi)注射；高劑量染毒組（C組）：按30mg／kg將PQ稀釋后腹腔內(nèi)注射。染毒后12h、24h、72h、120h，各組隨機取5只大鼠處死，右腎制備10%的組織勻漿，左腎10%中性甲醛固定行病理觀察及免疫組化染色。

2 主要試劑 20%PQ溶液（英國先正達公司），TNF－α檢測試劑盒（深圳晶美生物工程公司），EnVision免疫組化檢測試劑盒（基因科技上海公司），兔抗鼠NF－κB P50多克隆抗體（美國Santacruz公司 貨號sc－114）。

3 TNF－α測定及HE染色 雙抗體夾心酶聯(lián)吸附法測定勻漿中的TNF－α濃度，HE染色病理觀察（切片厚5μm）。

4 腎組織NF－κB的免疫組化分析 腎組織切片烤片脫蠟后，浸入檸檬酸緩沖液高壓抗原修復(fù)（121℃5min），自然冷卻至室溫。滴加稀釋的一抗（Antibody Diluent稀釋），4℃過夜。滴加生物素標(biāo)記二抗（Chem Mate En TMVision＋／HRP）工作液，室溫30min，以PBS代一抗作陰性對照，DAB顯色，肉眼看到棕色立即終止染色，透明及封片，電鏡下觀察陽性細胞。每只大鼠制片5張，光鏡下隨機選取4個完整且不重疊高倍視野（×400），以胞漿或胞核出現(xiàn)棕黃色著色顆粒為陽性標(biāo)記。判斷結(jié)果采用免疫組織化（Immunohistochemistry score，IHS）標(biāo)準(zhǔn)，分別按陽性細胞百分數(shù)及陽性細胞染色強度計分［4］：A為陽性細胞數(shù)比例分級0（0～1%）、1（1%～10%）、2（10%～50%）、3（50%～80%）、4（80%～100%），B為陽性細胞顯色強度分級0（陰性）、1（淺黃色為弱陽性）、2（淺棕黃色為陽性）、3（棕黃色為強陽性）；IHS＝A×B。

結(jié) 果

1 大鼠染毒后表現(xiàn)：A組大鼠活動靈敏，尿量正常；B組大鼠8～20h出現(xiàn)食欲減退，呼吸急促等；C組大鼠1～3h出現(xiàn)倦怠、嗜睡、煩躁、走路不穩(wěn)、頭顫，食水量明顯減少，呼吸急促，血尿、少尿或無尿，還有松毛、易捕捉等癥狀。

2 腎功能檢測結(jié)果：PQ染毒后大鼠出現(xiàn)腎功能損害，且隨染毒劑量和時間呈正相關(guān)，見表1。

3 腎組織勻漿TNF－α動態(tài)變化及其意義：大鼠腎組織TNF－α染毒后12h開始逐漸升高，至觀察終點仍處于較高水平，C組明顯高于B組，提示急性PQ中毒早期腎臟炎性損傷過程中，TNF－α可能起重要作用，見表2。

4 腎臟組織病理學(xué)觀察：A組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細胞浸潤，小管內(nèi)無管型及顆粒（圖1）；B組腎小靜脈及間質(zhì)毛細血管淤血，小管上皮細胞腫脹及管腔變窄，72h可見水腫滲出、壞死，間質(zhì)可見炎性細胞浸潤（圖2）；C組早期可見小血管擴張淤血，小管上皮腫脹重，包膜張力增大及出血點、淤血，皮髓質(zhì)界限模糊，可見大量炎性細胞浸潤及部分細胞破壞，管腔內(nèi)有蛋白管型 （圖3）。

5 腎組織NF－κB的表達，見表3。

表1 三組不同時間點血清Cr、BUN水平（±s）

表1 三組不同時間點血清Cr、BUN水平（±s）

注：與A組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

組 別 12h 24h 72h 120h A組 Cr（μmol／L）BUN（mol／L）37．0±1．66 8．7±1．26 36．2±2．67 8．5±1．67 36．4±2．23 8．7±1．23 35．5±1．32 8．5±1．32 B組 Cr（μmol／L）BUN（mol／L）63．5±4．70＊13．5±2．30＊C組 Cr（μmol／L）BUN（mol／L）38．1±2．23 10．8±1．23 39．2±1．21 12．2±1．21＊54．1±3．45＊14．1±2．45＊43．4±2．59＊15．5±2．57＊88．6±6．10＊＊19．6±3．1＊108．4±2．43＊＊25．4±2．43＊＊112．0±5．92＊＊24．0±3．92＊＊

表2 三組不同時間點腎組織TNF－α水平（μg／L，±s）

表2 三組不同時間點腎組織TNF－α水平（μg／L，±s）

注：與 A組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001；與B組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01

組 別 12h 24h 72h 120h A組 7．34±0．25 6．85±0．64 7．33±0．52 7．40±0．45 B組 10．33±0．48 12．45±0．62＊ 28．46±1．53＊＊ 25．36±1．28＊＊C組 12．40±3．62＊ 22．41±3．78＊＊△ 39．65±4．02＊＊＊△△ 36．65±3．27＊＊＊△△

表3 三組不同時間點腎組織NF－κB的IHS評分（±s）

表3 三組不同時間點腎組織NF－κB的IHS評分（±s）

注：與 A組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001；與B組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01

組 別 12h 24h 72h 120h A組 0．12±0．03 0．05±0．01 0．06±0．02 0．05±0．01 B組 0．47±0．05 1．65±0．12＊ 1．98±0．18＊＊ 2．1±0．25＊＊C組 1．87±0．14＊△ 5．62±0．78＊＊＊△△ 6．96±0．54＊＊＊△△ 8．20±0．82＊＊＊△△

A組NF－κB不表達或很少表達，僅見極少數(shù)腎小管細胞漿棕黃色淡染，各時間點間無差異（圖4）；B組NF－κB表達在12h與A組大鼠無明顯差異，而在24h、72h、120h表達增多，并隨時間延長呈線性升高趨勢，至觀察結(jié)束仍保持較高水平，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（圖5）；C組NF－κB表達在12h即升高，以后各時間點隨時間延長呈線性升高趨勢，72h左右達到高峰且見核表達。C組NF－κB表達在12h較A組及B組均有顯著性差異；在24h、72h、120h較A組有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，較B組有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（圖6）。

結(jié)果提示：急性PQ中毒后腎組織NF－κB表達較早且非常強烈，尤其在C組，結(jié)合臨床重度中毒者早期發(fā)生腎功能損害比例高，可能有較重要的意義。

討 論

PQ造成機體損傷是多系統(tǒng)、多器官、多水平的，體內(nèi)的PQ主要以原形從腎臟排出，24h內(nèi)可排出50%～70%。一項關(guān)于PQ中毒薈萃分析［5］，檢索了1994年至2006年國內(nèi)期刊數(shù)據(jù)庫公開發(fā)表的論文及Medline相關(guān)報道1069例患者，腎損傷的發(fā)生率高達64．9%，其中死亡466例占到腎損傷的67．1%，可以看出腎損傷是影響預(yù)后的重要因素。目前認為氧化應(yīng)激、炎性損傷、基因異常、細胞凋亡、鈣超載等諸多因素參與腎損害的發(fā)生與發(fā)展。

NF－κB作為一種多效轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)多種細胞因子和炎性介質(zhì)表達中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，逐漸證實它激活后在感染、中毒等疾病致多臟器功能損害中的重要角色。佟飛等［6］建立大鼠急性肺損傷模型后，采用電泳遷移率法檢測大鼠肺組織NF－κB活性，發(fā)現(xiàn)染毒組NF－κB活性明顯高于對照組和治療組，提示急性肺損傷時NF－κB活性增強。TNF－α參與機體炎癥反應(yīng)和免疫過程，是介導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，可以通過NF－κB誘導(dǎo)表達，也可以通過自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)自身及其它因子的表達，對腎臟產(chǎn)生潛在的損害作用。NF－κB主要由P50和P65兩個亞基組成，通常與抑制蛋白IκB形成三聚體，以失活狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中。氧化應(yīng)激時，機體活性氧大量增加引起IκB－NF－κB復(fù)合體降解，NF－κB活化，在基因水平啟動包括TNF－α、IL－8等炎癥因子和炎性介質(zhì)的表達，參與炎癥、組織器官纖維化、細胞再生和凋亡等病理生理過程。已有研究提示急性PQ中毒后NF－κB被激活上調(diào)TNF－α的轉(zhuǎn)錄，使TNF－α等炎性因子生成增多，研究同時發(fā)現(xiàn)TNF作為細胞因子家族中最強效的炎癥介質(zhì)，在結(jié)合TNF－R以后，可刺激 NF－κB與IKB解離。此時，TNF－α－NF－κB 形成了一個正反饋 信號，促使TNF－α大量表達，這種惡性循環(huán)在及 MODS的發(fā)生發(fā)展中有重要意義。

本研究成功建立PQ腹腔注射染毒大鼠動物模型，染毒后數(shù)小時出現(xiàn)不同程度的血尿、少尿或無尿及神經(jīng)精神癥狀，血肌酐、尿素氮升高，HE染色見腎小球體積增大，近曲小管上皮細胞腫脹、變性、空泡樣變、壞死，腎小管管腔變窄甚至閉鎖，間質(zhì)充血、水腫、炎性細胞浸潤，提示PQ中毒早期可致腎損傷，尤其在重度中毒組。

實驗發(fā)現(xiàn)腎組織TNF－α濃度在B組24h、C組12h時開始升高，以后的時間點呈逐漸增加趨勢，尤其在NF－κB表達后顯著升高，在時間上與腎組織病理損害程度相關(guān)，故認為TNF－α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與急性腎損傷的發(fā)生與發(fā)展過程。本研究顯示PQ中毒后12h即出現(xiàn)腎臟組織NF－κB的表達升高，且持續(xù)較長時間，提示NF－κB可能參與了腎臟炎性損害及功能衰竭的發(fā)生。中毒后24h大鼠腎組織TNF－α水平開始升高，至72h達峰值，各時間點結(jié)果與對照組比較均有顯著性差異，且腎組織TNF－α明顯升高出現(xiàn)在NF－κB高表達之后，提示NF－κB被激活后上調(diào)TNF－α的轉(zhuǎn)錄，使TNF－α生成增多。NF－κB活化抑制炎癥細胞凋亡，導(dǎo)致炎癥細胞數(shù)量異常增加，炎癥細胞過度激活后釋出大量細胞因子和炎癥介質(zhì)，造成組織損傷。而組織損傷、大量的促炎細胞因子和炎癥介質(zhì)反過來又促進NF－κB的活化，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，使機體出現(xiàn)器官損傷或功能障礙。通過以上實驗推測，NF－κB參與的炎癥反應(yīng)，也是PQ中毒者多臟器功能障礙或死亡的－個重要因素。

已有研究表明，NF－κB在炎性介質(zhì)的激活和SIRS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，本研究發(fā)現(xiàn)在PQ中毒后腎組織NF－κB高表達，提示NF－κB可能參與了PQ中毒早期腎臟損害，如果在疾病早期適度地抑制NF－κB的激活，進而下調(diào)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，將會為治療急性PQ中毒早期引起的腎臟損傷和器官衰竭提供－種新的治療辦法。

［1］ 陳世銘，高連永．急性中毒的診斷與救治［M］．北京：人民軍醫(yī)出版社，1996：179－182．

［2］ Hwang KY，Lee EY，Hong SY，et al．Paraquat in toxieation in Korea［J］．Archives of Environmental Health，2002，57（2）：162－166．

［3］ 耿東升．NF－κB及其致炎作用和化學(xué)抑制劑［J］．解放軍藥學(xué)學(xué)報，2009，25（3）：250－25．

［4］ Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al．Cox－2is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors［J］．Cancer，2000，89（3）：2637－2645．

［5］ 劉芙蓉，石漢文，扈 琳，等．腎損傷對百草枯中毒患者預(yù)后影響的分析［J］．臨床薈萃，2008，23（2）：119－121．

［6］ 佟 飛，田英平，霍書花，等．P38MAPK及核因子－κB在百草枯致大鼠肺損傷中的變化［J］．中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2007，25（9）：518－522．