姜黃素通過內質網應激途徑誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡的實驗研究＊

姜黃素（Curcumin）提純自中藥姜黃（Curcuma longa L．）的根莖，屬于酚性色素，其化學名為阿魏酰甲烷（Difcruloylmethane）。中醫認為姜黃具有祛風活血以及通絡止痛等功效。從20世紀80年代至今，大量研究表明，姜黃素具有較強的抗腫瘤活性，可誘導腫瘤細胞凋亡［1－2］。近年研究表明，內質網應激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）是有別于線粒體途徑及死亡受體途徑的可誘導細胞凋亡的獨立通路。本研究采用姜黃素對宮頸癌HeLa細胞進行干預，探討姜黃素是否能夠通過ERS途徑誘導HeLa細胞凋亡，為姜黃素的臨床應用提供新的依據。

材料與方法

1 材 料 宮頸癌細胞株HeLa購自中國科學院細胞庫；四甲基偶氮唑藍（MTT）、姜黃素（C21H20O6，純度≥98%）、ERS抑制劑4－苯基丁酸鈉（4－PBA）購自美國Sigma－Aldrich公司；DMEM細胞培養基以及胎牛血清（FBS）購自美國Hyclone公司；Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；Prime－Script RT Master Mix試劑盒以及SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒購自日本Takara公司；葡萄糖調節蛋白78（GRP78），C／EBP同源蛋白質（CHOP）以及β－Actin引物均由日本Takara公司合成；GRP78及CHOP抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；β－Actin抗體及辣根過氧化物酶標記二抗均購自美國Santa Cruz公司。

2 宮頸癌HeLa細胞培養 向DMEM培養基中加入10%FBS、0．1U／L鏈霉素以及0．1U／L青霉素制成細胞培養液對HeLa細胞進行培養。培養條件為37℃、飽和濕度以及5%CO2環境，隔天更換細胞培養液，細胞密度為80%以上時按照1∶3的比例對細胞進行傳代，取處于對數生長期的HeLa細胞進行進一步試驗。

3 MTT法檢測姜黃素對HeLa細胞增殖的抑制作用 將HeLa細胞制成濃度為1×105／ml的細胞懸液，將該細胞懸液加入96孔板（GREINER，德國），共設6個平行孔，每孔加入100μl細胞懸液。6個平行孔中加入的姜黃素溶液（均由DMEM培養基配制）濃度分 別 為 0μmol／L（陰 性 對 照）、3．125μmol／L、6．25μmol／L、12．5μmol／L、25μmol／L 以及50μmol／L。干預48h后，向每孔中加入濃度為5mg／ml的 MTT溶液20μl繼續培養4h，棄去上清液后加入二甲基亞砜（DMSO）150μl，充分震蕩后，使用酶標儀測定波長為570nm處的吸光度值（A值）。采用以下公式對細胞生長抑制率進行計算：細胞生長抑制率＝（1－樣本平均A值／陰性對照平均A值）×100%。

4 試驗分組 本研究中將細胞樣本共分為對照組（Ctrl）、對照＋4－PBA組（Ctrl＋PBA）、姜黃素組（Cur）以及姜黃素＋4－PBA組（Cur＋PBA）。姜黃素濃度為下文MTT法中篩選出的姜黃素最適濃度；根據Kubota等 的 研 究［3］，選 擇 3mmol／L 作 為 4－PBA 溶 液 （由DMEM細胞培養基溶解）的干預濃度。

5 流式細胞儀測定宮頸癌HeLa細胞凋亡 將各組樣本細胞分別離心，采用含0．2%FBS的磷酸鹽緩沖液（PBS）對細胞進行洗滌后加入70%乙醇溶液中固定，將各組樣本細胞懸液濃度調整為1×106／ml后先后采用Anexin V及PI（BD，美國）進行雙染，流式細胞儀（FACSCalibur，BD，美國）檢測熒光強度后進行分析。

6 Real－time PCR 收集細胞樣本后，采用 Trizol法提取總Mrna，紫外分光光度計檢測純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性后，采用PrimeScript RT Master Mix試劑盒進行逆轉錄合成cDNA，并以該cDNA為模板采用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒進行Real－time PCR。GRP78、CHOP及β－Actin的引物序列［4］詳見表1。擴增條件如下：94℃預變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，再以72℃延伸45s，共進行25個循環，最后再以72℃延伸10min。上述試劑盒使用均嚴格按照廠家說明書進行。以β－Actin mRNA表達水平作為內參，Bio－Rad IQ5（Bio－Rad，美國）軟件對所得數據進行分析。

表1 Real－time PCR引物序列

7 Western Blotting 將樣本細胞離心，PBS洗滌2次，采用加入PMSF（Santa Cruz，美國）RIPA裂解緩沖液（Santa Cruz，美國）對細胞進行處理，采用BCA法對獲得的蛋白濃度進行測定后，加入等量1×SDSPAGE loading buffer，100℃ 變 性 5min 后 進 行 SDSPAGE垂直電泳，電轉至PVDF膜上，10%脫脂牛奶封閉1h，一抗孵育過夜，充分洗滌后加入二抗（1∶5000）孵育2h，充分洗滌后，采用Super Signal West Pico化學熒光發光試劑盒（Thermo，美國）對所檢測蛋白進行顯影，X膠片曝光后，以β－Actin作為內參，采用Image－Pro Plus（Version 5．0．2）軟件對結果進行分析。

8 統計學處理 本研究所得數據均采用（均數±標準差）表示，數據均錄入Excel并采用統計學軟件SPSS 17．0進行分析處理，統計方法為單因素方差分析，均以P＜0．05為差異具有統計學意義。

結 果

1 MTT法檢測姜黃素對HeLa細胞的生長抑制率與姜黃素干預濃度確定 陰性對照HeLa細胞生長活躍，分 別 采 用 3．125μmol／L、6．25μmol／L、12．5μmol／L、25μmol／L以及50μmol／L濃度的姜黃素溶液對HeLa細胞干預48h后，細胞生長均受到不同程度的抑制，并呈現出濃度依賴性，與陰性對照相比具有統計學意義（P＜0．05）。本研究選取25μmol／L作為后續試驗中姜黃素的干預濃度。見表2。

2 姜黃素對各組HeLa細胞凋亡的影響 在流式細胞分析圖上，正常細胞處于Q3區，早期凋亡細胞處于Q4區，晚期凋亡細胞／壞死細胞處于Q2區，細胞碎片則處于Q1區。處于（Q2＋Q4）區的細胞占細胞總數的百分比即為細胞凋亡誘導率。本研究發現，Ctrl組、Ctrl＋PBA組、Cur組以及Cur＋PBA組凋亡誘導率分別為4．15%、5．22%、68．37%以及49．28%。與Ctrl及Ctrl＋PBA組相比，Cur組HeLa細胞凋亡誘導率顯著升高（P＜0．05）；與Cur組相比，Cur＋PBA組HeLa細胞凋亡率顯著降低（P＜0．05）。見圖1。

圖1 流式細胞術檢測各組HeLa細胞凋亡情況比較

3 姜黃素對各組HeLa細胞GRP78及CHOP mRNA表達的影響 本研究發現，與Ctrl組及Ctrl＋PBA組相比，Cur組GRP78及CHOP mRNA表達水平均顯著升高（P＜0．05）；與Cur組相比，Cur＋PBA組GRP78及CHOP mRNA表達水平均顯著降低（P＜0．05）。見圖2。

4 姜黃素對各組HeLa細胞GRP78及CHOP蛋白表達水平的影響 本研究發現，與Ctrl組及Ctrl＋PBA組相比，Cur組GRP78及CHOP蛋白表達水平均顯著升高（P＜0．05）；與Cur組相比，Cur＋PBA組GRP78及CHOP蛋白表達水平均顯著降低（P＜0．05）。見圖3。

表2 不同濃度姜黃素溶液對HeLa細胞生長抑制的情況（48h）

圖2 姜黃素對各組HeLa細胞GRP78及CHOP mRNA水平的影響

圖3 姜黃素對各組HeLa細胞GRP78及CHOP蛋白表達水平的影響

討 論

作為發病率僅次于乳腺癌的第二大女性惡性腫瘤，宮頸癌對女性健康危害極大。目前，對于早期宮頸癌，臨床治療以手術切除為主，而對于中晚期患者，化學治療等藥物治療則成為主要治療方式。雖具有較強的抗腫瘤活性，但化學治療藥物具有細胞毒性大、不良反應多等缺點，因此具有高效低毒特點的抗腫瘤藥物具有廣闊的應用前景。姜黃素為中藥姜黃的主要有效成分，研究表明除具有抗炎、抗脂質過氧化、降血壓以及抗纖維化等藥理活性外［5］，近年越來越多的研究表明，姜黃素還具有顯著的抗腫瘤活性，對人肝癌細胞SMMC7721、乳腺癌、人類白血病細胞 HL－60以及人舌癌細胞Tca8113等細胞系均具有顯著的抑制作用，能夠誘導腫瘤細胞出現顯著的凋亡［6］。

細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，是有別于細胞壞死的細胞死亡方式。誘導腫瘤細胞凋亡是多種化療藥物的共同作用機制，可以作為藥物抗腫瘤能力的衡量標準之一。已經有研究證實，姜黃素不但能抑制宮頸癌細胞系Siha在體內、外的增殖，而且姜黃素能夠誘導宮頸癌細胞系HeLa、SiHa、CaSki以及C33A發生明顯凋亡［7－8］。本研究通過 MTT法及流式細胞術證實，姜黃素不但對宮頸癌細胞系HeLa增殖具有顯著的抑制作用，而且能夠誘導其發生凋亡，這與既往文獻報道一致。

一般認為，內、外因素能夠通過線粒體途徑、死亡受體途徑以及ERS途徑誘導細胞凋亡。ER是重要的細胞器，是新生蛋白質合成與加工的重要場所，對維持細胞內環境穩定與正常功能具有關鍵作用。在不良信號的刺激下，內質網所發生的鈣離子平衡失調以及未折疊蛋白反應（UPR）等，稱為ERS［9］。嚴重而持續的ERS可直接導致細胞凋亡的發生。作為定位于內質網內的折疊伴侶蛋白，GRP78被認為是ERS發生的主要分子標志之一［10］。ERS發生可最終導致轉錄因子CHOP的活化，作為ERS誘導凋亡信號通路下游的關鍵分子，表達增高的CHOP不僅可抑制抗凋亡蛋白BCL－2的表達，而且能夠促進促凋亡蛋白BAX／BAK的表達，最終誘發Caspase分子級聯反應，DNA內切酶PARP活化，后者使細胞核內的DNA降解，細胞發生凋亡［11］。4－PBA屬于低分子量游離脂肪酸的一種，是一種用于治療鳥氨酸循環障礙疾病的經典藥物。新近研究表明，作為一種化學伴侶，4－PBA對ERS可起到抑制作用［12］。

本研究發現，使用姜黃素處理HeLa細胞后，在發生增殖抑制及細胞凋亡的同時，HeLa細胞內GRP78及CHOP在轉錄水平及翻譯水平表達增高，提示姜黃素可通過內質網應激途徑誘導HeLa細胞凋亡。本研究進一步發現，在使用姜黃素對HeLa細胞進行干預后，使用ERS抑制劑4－PBA能夠顯著降低HeLa細胞的凋亡率，同時HeLa細胞內內質網應激標志物GRP78與凋亡誘導分子CHOP的mRNA及蛋白表達水平均被顯著抑制，該結果進一步說明姜黃素能夠通過激活ERS相關通路誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡。

［1］ 朱 青，張王剛，劉蘇虎，等．姜黃素誘導腫瘤細胞凋亡的實驗研究［J］．陜西醫學雜志，2005，34（10）：1185－1186，1192．

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［6］ Masuelli L，Benvenuto M，Fantini M，et al．Curcumin induces apoptosis in breast cancer cell lines and delays the growth of mammary tumors in neu transgenic mice［J］．J Biol Regul Homeost Agents，2013，27（1）：105－119．

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