大鼠脊髓擠壓傷后硫酸軟骨素蛋白多糖NG2在時間和空間的變化＊

中樞神經系統損傷后，星形膠質細胞（AST）活化，活化的AST又激活其它膠質細胞一起形成膠質瘢痕，以前認為膠質瘢痕以物理方式阻礙神經細胞和軸突的再生，進一步的研究發現硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPGs）是瘢痕中最重要的再生抑制物之一。脊髓損傷早期神經再生失敗的可能原因有Nogo－A、MAG及OMgp等的影響，最終誘導生長錐塌陷，抑制軸突再生。而CSPGs是神經膠質瘢痕中最重要的再生抑制物，應用硫酸軟骨素酶（Chondroitinase ABC）直接中和CSPGs被認為是最有希望的再生治療策略。CSPGs是一類細胞外基質分子，主要由星行膠質細胞（AST）產生。脊髓損傷局部通過免疫沉淀或原位雜交方法顯示CSPGs高表達，而且CSPGs沉積部位正是軸突停止再生的部位［1］；其次是體外多種CSPGs分子對軸突生長的抑制作用。研究表明蛋白多糖是中樞神經系統細胞外基質的主要成分，每個神經元周圍基質中硫酸軟骨素蛋白多糖的含量不同，提示它是調節神經元微環境的關鍵因素［2］。以上這些實驗都說明CSPGs是一種抑制中樞神經軸突生長的物質。CS－56的表達反映著NG2（神經元膠原抗原2，neuron－glial antigen 2）的水平，NG2是CSPGs的主要成分，因此也就是反映著CSPGs的抑制水平。CSPGs成員眾多，迄今已發現有30多種，按照蛋白質和糖鏈組成和連接的不同，可以分為3類，我們選擇最主要的成分NG2作為研究對象。觀察大鼠脊髓擠壓傷后硫酸軟骨素蛋白多糖NG2在時間和空間的變化，現報道如下。

材料與方法

1 實驗動物 成年雄性Sprague－Dawley大鼠，體重200～230g（西安交通大學實驗動物中心提供）（n＝6），采用大鼠脊髓擠壓傷模型［3］，注意大鼠術后護理：每日2次擠尿，保持皮膚干燥，預防褥瘡。

2 脊髓壞死面積的測量 選取包含脊髓損傷中心在內的矢狀位HE切片，在OlympusBX－60光學顯微鏡（Olympus，日本）的明視野下，經4倍鏡對損傷區組織進行觀察并采集數字化圖象，在Camera lucida（Opton，德國）顯微描繪器下將同一切片同視野壞死區的輪廓和比例尺放大描繪于A4打印紙上。隨后利用Photoshop7．0圖象處理軟件（Adobe，美國）獲得所選區面積的總像素值，計算顯微照片的標尺長度，在照片上繪制單位面積，計算機軟件讀取其面積內的像素值，可獲取單位面積的像素值，再乘以單位面積的實際面積，即得到壞死區的實際面積。

3 大鼠脊髓損傷區CS－56免疫熒光染色 應用ABC法進行免疫組織化學染色。切片經空氣干燥后，入0．01mol／L的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7．4）清洗30 min，用含1%小牛血清白蛋白和0．3%Triton X－100的抗體稀釋液室溫下封閉2h，然后加入CS－56抗體（CS－56，1︰1000，Sigma），室溫下孵育過夜，切片經PBS清洗后，加入生物素化的的抗山羊IgG（1︰200，Sigma）室溫下孵育3h，再經PBS清洗后，置于ABC復合物中（1︰400，Sigma）室溫下孵育3h，經PBS清洗后用葡萄糖－葡萄糖氧化酶－硫酸鎳銨－DAB加強法進行顯色，切片在顯色液中孵育15～25min，顯色液為100ml 0．1mol／L醋酸鹽緩沖液含有70mg DAB、200mg葡萄糖、40mg NH4Cl、3g硫酸鎳銨和1mg葡萄糖氧化酶。然后在空氣中干燥，梯度酒精脫水，二甲苯透明，DPX封片，O－lympus BX－51顯微鏡下觀察照相。

結 果

1 擠壓傷后各時相點壞死區平均面積 見附表。脊髓擠壓傷后由于出血，組織壞死等原因壞死區面積逐漸增大，到72h后達到峰值。隨后由于出血吸收，壞死區面積趨于穩定。

附表 擠壓傷后各時相點壞死區平均面積（mm2）計算結果

2 CS－56和GFAP的關系 CS－56是CSPGs的特異性標記物。脊髓擠壓后在損傷部位即可見到CS－56免疫反應增加，CS－56表達于24h內開始升高，分布于星形膠質細胞內。到2周時明顯增多，充填于空洞腔內。GFAP于受傷當時主要分布于脊髓損傷的緊靠斷端附近，分布比較稀疏；24h后主要分布于損傷區的周圍，而損傷的斷端逐漸減少；48h后GFAP的“積聚”表達現象最為明顯；1周時GFAP的表達達到高峰，而2周時的表達呈明顯地下降趨勢。CSPGs主要集中表達于損傷中心，GFAP表達陽性產物則逐漸向損傷區域的邊緣集中形成星形細胞瘢痕及其界膜，在損傷區內部少見，另可見空洞形成。（見圖1、圖2、圖3）。

圖1 擠壓傷后損傷區GFAP－CS56染色后的情況

討 論

圖2 72h后損傷區周圍GFAP－CS56表達

圖3 損傷2周時GFAP－CS56表達

脊髓損傷（SCI）后再生修復能力有限與受傷時的機械性因素和傷后所產生的化學性因素有關，前者是指傷后局部膠質瘢痕的空間阻礙，機械性損傷因素可認為是脊髓的原發性損傷，對于嚴重的損傷，這一病理過程是無法控制且不能選擇的。而化學性因素所導致的繼發性損傷此時就決定著預后情況，但這一過程確實可以通過一系列的治療措施加以糾正，至少可以阻斷病理過程的進一步演進。所以應該把脊髓損傷的治療重點放在對繼發性損傷的控制上來。目前認為，中樞神經系統（CNS）抑制因子對SCI后再生修復有顯著的抑制作用，而主要的抑制因子有髓鞘結合分子（Nogo－A）、髓鞘糖蛋白（MAG）和細胞外基質等。硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPGs）的抑制作用更為明顯，故被作為本實驗的研究對象。各種CSPGs中，NG2，Versican，Neurocan，Brevican，Phosphacan在SCI后的表達并 不 一 致。Leonard 等［4］認 為，NG2 是 主 要 的CSPGs，其由少突神經膠質細胞前體表達。SCI后CSPGs表現出強大的抑制作用，具體表現為抑制軸突和神經細胞的再生修復［5］。Davies等［6］發現將周圍神經系統神經元植入大鼠的脊髓后能夠再生，但再生的軸突到達硫酸軟骨素蛋白多糖豐富的損傷區后就停滯不前。這表明，硫酸軟骨素蛋白多糖對中樞神經系統損傷后的軸突再生有相當的抑制作用。

因此了解脊髓損傷后CSPGs的時空分布變化，有助于理解脊髓損傷后軸突不能再生的機制，根據CSPGs的時程變化可制定針對于CSPGs的治療，并評估治療的結果。研究表明神經突起的生長會避開CSPGs，從而CSPGs起到引導突起生長的作用［7－8］。隨著星形膠質細胞的反應性增生，膠質瘢痕及損傷區域空洞的形成，損傷區被包裹局限，在損傷中心區域，CSPGs有大量積累，而在離損傷區較遠區域表達逐漸降低。

本實驗結果顯示，NG2在SCI后24h內開始上升，1周達到高峰，后繼續維持這種高水平的表達至傷后2周。NG2通常與細胞表面相結合，體外可表達于少突膠質細胞和纖維型星形膠質細胞表面。CSPGs被發現可以抑制層粘連蛋白（Laminin）的促進軸突生長的特性。免疫熒光染色結果顯示，CS－56表達于24h內開始升高，3d后CS－56呈環狀分布于損傷區周圍，GFAP有少量表達。1周時空洞逐漸出現，GFAP的表達集中于損傷的遠近端，CS－56的表達逐漸增強，2周時空洞輪廓明顯，CS－56充填于空洞腔內，而此時GFAP的表達有所下降。

CS－56的表達反映著NG2的水平，也就是反映著CSPGs的抑制水平。中樞神經系統的細胞基質中，不僅存在著能促進神經元生長、存活和影響可塑性的神經營養因子，還存在著許多抑制神經細胞生存、生長和修復的抑制因子。新近的研究發現細胞外基質中還有對神經元分化、再生過程既有促進作用，又有抑制作用的蛋白多糖，其中CSPGs被認為具有這種作用［7］。而研究CS－56的時間和空間分布對于有針對性脊髓繼發性損傷的治療具有指導作用，比如本實驗所顯示的在損傷后1周時其表達逐漸開始增強，這就可以確定治療的時間窗問題?；瘜W性屏障的作用在脊髓損傷的發生機理中占有關鍵位置，將治療重點置于此才可能在治療方法的組合上有新的進展。

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