8－甲氧基補骨脂素柔性納米脂質體不同研制方法的比較＊

廣東省第二人民醫院皮膚科（廣州510317） 鄭榮昌 馬 靜 周貴濱 秦 思 溫 炬

柔性納米脂質體（flexible nano－liposomes，FNL）又稱傳遞體或變形脂質體，是將表面活性劑（如膽酸鈉、去氧膽酸鈉等）加入到制備脂質體的類脂材料中制成的具有高度自身形變、可高效地穿過比其自身小數倍的皮膚孔道的類脂質體，具有高效滲透性、高度柔韌性和高親水性［1］。柔性納米脂質體的結構類似生物膜，是一種多功能的定向藥物載體，能使更多的藥物保留在皮膚中，減少藥物進入血循環，在表皮和真皮內形成藥物貯庫，使藥物持久地作用于病變部位。8－甲氧基補骨脂素（MOP）是治療白癜風的重要藥物［2］。本實驗通過不同方法研制8－甲氧基補骨脂素柔性納米脂質體，篩選合適的制作方法。

材料與方法

1 材 料 ①試 劑：注射用大豆磷脂（上海浦江磷脂有限公司），膽固醇（中國醫藥（集團）上海化學試劑公司），膽酸鈉（中國醫藥（集團）上海化學試劑公司），8－甲氧基補骨脂素（重慶友邦制藥），所有試劑均為分析純。②儀器：日立H－00透射電鏡（日本Hitachi公司），高效液相色譜儀（日本島津公司），旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠），超聲波粉碎機（美國Auto Science），分析天平（中國湖南湘儀廠），酸度計（上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠），改良的Franz擴散池（自制），UV－2201紫外可見分光光度計（日本島津），電子恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

2 方 法 基本配方：根據正交實驗設計及預試驗，確定基本配方：大豆磷脂∶膽固醇∶MOP∶膽酸鈉＝20∶10∶3∶10，分別采用逆相蒸發法、乙醚注入法、薄膜法、薄膜－超聲法等方法制備MOP柔性納米脂質體。①逆相蒸發法制備大單層脂質體：按處方量將藥物溶于60ml氯仿－甲醇（（2∶1）液，加入PBS 15ml，水浴式超聲儀超聲30min，倒入500ml燒瓶中，置于40℃水浴，減壓除去有機溶劑，達膠態后滴加PBS（10mmol／L）5ml，旋轉使壁上的凝膠脫落，繼續減壓蒸發即可制得透明的均勻乳白色液體。②乙醚注入法：水相：磷酸鹽緩沖液（（0．05mol／L，pH7．3）4ml放入試管中，置于55℃至60℃水浴中；有機相：乙醚2ml溶解總脂及 MOP；用帶5號針頭的注射器以0．25ml／min速度將有機相注入水相中，不斷攪拌至有機溶劑除盡，直至得到透明的均勻乳白色液體。③薄膜法制備多室脂質體：按處方量將藥物溶于60ml氯仿－甲醇（2∶1）液，置于500ml圓底燒瓶中，用旋轉蒸發器減壓旋轉去除有機溶劑，形成均勻薄膜。取5ml PBS（10mmol／L）加熱至55℃，傾入薄膜中，浸入55℃水浴中攪拌30min，直至得到透明的均勻乳白色液體。④薄膜－超聲法制備小單層脂質體：將③制得的脂質體再經超聲即得。用水浴式超聲處理機處理30min，再在探頭式超聲儀上超聲粉碎5次，每次3min，直至形成均勻的上清液。4000g離心10min，收集上清液得到透明的均勻乳白色液體。

3 納米脂質體質量評價 ①高效液相色譜（HPLC）測定MOP柔性納米脂質體含量：取1ml脂質體以PBS稀釋至100ml，取5ml置于25ml量瓶中，加甲醇定容，超聲5min，0．45μm 微孔濾膜過濾后，精密進樣2μl。另取 MOP對照品溶液（10ug／ml）20μl進樣，外標法計算含量。②凝膠柱法測定包封率：取MOP柔性納米脂質體1g，用PBS 20ml混懸均勻，上葡Sephadex G－25柱，用PBS洗脫，接取流分100ml，流速3ml／min，取含藥脂質體流分5ml置于25ml量瓶中，加甲醇定容，超聲處理5min，0．45mm微孔濾膜過濾，取20μl進樣，計算包封于脂質體中的藥物W1。同時，取柔性納米脂質體1g，用PBS 100ml混懸均勻，然后取5ml用甲醇稀釋至25ml，超聲處理5min，0．45μm微孔濾膜過濾，進樣20μl。計算得總藥物量W2，按下式計算包封率：EE＝W1／W2×100%。③負染－電鏡法測定粒徑：取柔性納米脂質體樣品適量，用PBS稀釋200倍，滴于銅網上，2%磷鎢酸負染，自然晾干，5000－20000倍電鏡下觀察并拍照。隨機測定5個視區，每個視區測定50個柔性納米脂質體的粒徑，以照片粒徑除以放大倍數即得柔性納米脂質體的粒徑大小。④Zeta電位測定：取MOP柔性納米脂質體1ml，PBS 1ml稀釋，檢測。測定條件：電流0．43mv、電場16．24V／cm、波長660nm。

4 統計學分析 采用SPSS13．0進行統計學分析。試驗結果以±s表示。各組均數間差異使用方差分析；P＜0．05為差異具有統計學意義。

結 果

1 不同制備方法MOP脂質體含量、包封率、平均粒徑、Zeta電位 見表1。逆相蒸發法制備的脂質體包封率低，粒徑大；乙醚注入法包封率低且平均粒徑小；薄膜法包封率高，粒徑大；薄膜－超聲法包封率高，平均粒徑適中。

表1 不同制備方法MOP脂質體含量、包封率、平均粒徑、Zeta電位的測定

2 時間對薄膜－超聲法制備脂質體質量的影響見表2。隨著超聲時間的延長，薄膜－超聲法制備的MOP柔性納米脂質體粒徑越小，同時包封率也明顯下降。

表2 時間對薄膜－超聲法制備脂質體質量的影響

討 論

FNL是將表面活性劑（如膽酸鈉、去氧膽酸鈉等）加入到制備脂質體的類脂材料中制成的具有高度自身形變、可高效地穿過比其自身小數倍的皮膚孔道的類脂質體，具有高效滲透性、高度柔韌性和高親水性。普通脂質體的制備配方中不含膽酸鈉。

不同工藝制備的脂質體的成層性、均勻性、粒徑、荷電等均不一樣，影響脂質體的包封率、穩定性以及脂質體與皮膚的的相互作用如脂質體滲透皮膚的量及程度。目前常用的方法有逆相蒸發法、乙醚注入法、薄膜法、薄膜－超聲法。逆相蒸發法通常制備大單層脂質體，特點是可包裹較大的水容積，適合于包裹水溶性藥物、大分子生物活性物質如胰島素、干擾素等，薄膜法常用于制備多室脂質體，超聲法制備的脂質體以小單層為多，因此應根據實驗目的選擇制備工藝。脂質體的大小影響其透皮吸收。直徑600nm以下的脂質體非常容易穿透皮膚，而直徑1000nm以上的脂質體則易停留在角質層內［3］。脂質體的荷電荷能夠減少相互間的聚集和融合，增加穩定性。通過調整組分的荷電性質和荷電量及介質的離子強度，可以使Zeta電位保持在足夠高的水平，阻止粒子間相互集聚。Zeta電位是衡量電荷多少的一個重要指標，當Zeta電位大于60mV時，荷電粒子相當穩定；Zeta電位在30～60mV時，荷電粒子比較穩定；Zeta電位小于30mv時，荷電粒子不穩定，容易聚集［4］。

本試驗中逆相蒸發法和薄膜法制備的MOP脂質體的包封率很高，但粒徑較大，且粒徑分布不均勻；乙醚注入法則包封率較低，僅為45．3%，且平均粒徑太小。薄膜－超聲法置備的MOP脂質體包封率高，平均粒徑適中，基本滿足皮膚局部用脂質體的粒徑要求，且Zeta電位負值較高，預示穩定性較好。薄膜－超聲法中超聲時間的長短也影響了脂質體的質量。超聲時間越長粒徑越小，同時包封率也有所下降較明顯。超聲15min獲得的脂質體包封率較高，平均粒徑大小合適，Zeta電位的負值也比較高。綜上所述，采用薄膜－超聲法，超聲時間15min是制備補骨脂素柔性納米脂質體是比較適宜的方法。

補骨脂素是白癜風治療最常用且療效肯定的藥物。目前局部外用補骨脂素有酊劑、凝膠，存在藥物滲透性差；易出現紅斑、水皰、大皰等副作用。補骨脂素柔性納米脂質體作為新型藥物載體，可減少相關副作用。在后續研究中將進一步探討補骨脂素柔性納米脂質體的藥代和藥效學特點。

［1］ Cevc G，Gebauer D，Stieber J，et al．Ultraflexible vessicles，Transfrsomes，have an extremely low pore penetration resistance and transport the rapeutic amountsof insulin across the intact mammalian skin ［J］．Biochem Biophy Acta，2008，1368（2）：201．

［2］ Jam WD，Berger T，Elston D．Andrews’Disease of the Skin［M］．The tenth edition．USA：Elsvier，2006：160．

［3］ Schramloval J，Blazek K，Bartackova M，et al．Electron microscopic demonstration of the penetration of liposomes through skin［M］．Folia Biol Praha，1997，43（4）：165．

［4］ 劉 輝，湯 韌，何曉霞，等．脂質體處方和制備方法對阿昔洛韋棕櫚酸酯脂質體穩定性的影響［J］．藥學學報，2002，37（7）：563－566．