蟾蜍靈聯(lián)合伊馬替尼對K562細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用＊

慢性髓系白血病（CML）是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，其特征是發(fā)生了相互的染色體移位 ［t（9；22）（q34；q11）］，產(chǎn)生了bcr／abl融合基因，編碼了異常的酪氨酸激酶，促使疾病的發(fā)生與發(fā)展。當(dāng)前，在bcr／abl融合基因陽性的病人中，酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼（IM）是首選的治療藥物。然而，在許多病例中，發(fā)生了對伊馬替尼的耐藥，尋找一種CML治療的替代或增敏藥物，無疑是非常重要的。蟾蜍靈是一種天然中藥，來源于中華大蟾蜍和黑框蟾蜍耳后及皮膚腺體分泌的漿液，是中藥蟾酥（華蟾素）主要的地高辛樣活性成分之一［1］。現(xiàn)已證實蟾蜍靈具有較強的抗腫瘤作用，對白血病細(xì)胞如 HL－60、K562、U937、ML－1、THP－1等也具有較強的分化及凋亡誘導(dǎo)作用［2－3］。本實驗研究蟾蜍靈對K562細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用及對伊馬替尼的增敏作用，以其對慢粒的治療提供新的依據(jù)。

材料與方法

1 材 料 蟾蜍靈（Bufalin）購于美國Sigma公司，溶于無水乙醇，配制成終濃度為0．01mol／L的儲存液，－20℃凍存。試驗時用1640稀釋，使乙醇終濃度控制在體積分?jǐn)?shù)＜0．1%。人紅白血病K562細(xì)胞系購自于西安交大第一附屬醫(yī)院中心實驗室，培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2孵育箱中培養(yǎng)、傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

2 方 法 MTT法：將K562細(xì)胞懸液調(diào)整為1×105／ml，接種于96孔板，每孔100ml，過夜后實驗組分別加入不同濃度的蟾蜍靈，終濃度分別為0．025μmol／L、0．01μmol／L、0．05μmol／L、0．5μmol／L、1．0μmol／L和2．0μmol／L，對照組不加藥，另設(shè)空白組（只有培養(yǎng)基，無細(xì)胞），每組3個復(fù)孔。將細(xì)胞分別分為蟾蜍靈組，蟾蜍靈＋伊馬替尼2．0μmol／L、1．0μmol／L和0．5μmol／L 組，繼續(xù)培養(yǎng)48h，加 MTT（5mg／ml）20ml，4h 后，離 心，棄 上 清，加 DMSO 200ml，避光震蕩5min，用全自動酶標(biāo)儀測490nm處的吸光度（A490）值。統(tǒng)計結(jié)果，每組取平均值計算抑制率：抑制率（%）＝（A對照－A實驗）／（A對照－A空白）×100%。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計軟件SPSS13．0進行統(tǒng)計學(xué)分析。試驗數(shù)據(jù)以±s表示，實驗組及對照組間差異采用t檢驗，以P＜0．05為差異顯著性界限。

結(jié) 果

實驗結(jié)果見附圖、附表。倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡特征性改變。和對照組相比，表現(xiàn)為細(xì)胞大小不一，包膜不完整，部分細(xì)胞溶解、碎裂。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，單用蟾蜍靈（B）組，濃度為2．0、1．0、0．5與0．1μmol／L之間、0．1與0．025μmol／L之間具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。各濃度組，加入伊馬替尼（IM）后組間相比差異無顯著性（P＞0．05）。0．025μmol／L濃度時B同B＋IM0．5、B＋IM1．0、B＋IM2．0組相比P 分別為0．053、0．057、0．100。可見蟾蜍靈可明顯抑制K562細(xì)胞生長并誘導(dǎo)凋亡，為劑量依賴性；在低濃度時蟾蜍靈和伊馬替尼具有協(xié)同作用，隨著伊馬替尼濃度的增加，對K562細(xì)胞的抑制率并不增加。

附圖 蟾蜍靈（B）聯(lián)合伊馬替尼（IM）對K562細(xì)胞的抑制作用

附表 蟾蜍靈（B）聯(lián)合伊馬替尼（IM）對K562細(xì)胞的抑制作用

討 論

近年來，關(guān)于天然中藥抗癌作用引起了國內(nèi)外學(xué)者的極大的興趣。蟾蜍靈的抗腫瘤作用于20世紀(jì)90年代開始受到廣泛的關(guān)注［3－5］。研究表明其可以抑制白血病細(xì)胞增殖、干擾細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞分化及凋亡［2－3］。蟾蜍靈誘導(dǎo)凋亡機制較為復(fù)雜，可以通過調(diào)節(jié)多種通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Na＋－K＋－ATP酶首先被認(rèn)為是蟾蜍靈誘導(dǎo)凋亡的重要靶點，蟾蜍靈通過抑制上述酶激活凋亡通路。后來的研究證實絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是蟾蜍靈誘導(dǎo)凋亡的一條重要通路［2－3］。蟾蜍靈還可以通過對腫瘤相關(guān)基因和蛋白的調(diào)節(jié)而誘導(dǎo)凋亡。Tiam1基因即T細(xì)胞淋巴瘤侵襲和轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)蛋白1，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究表明0．1μM的蟾蜍靈作用于K562細(xì)胞，Tiam1的mRNA及蛋白表達明顯上升，而且Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1（Rac－1），p21蛋白活化激酶（PAK）和JNK 被激活，表明Tiam1在蟾蜍靈通過Rac－1－PAK－JNK誘導(dǎo)凋亡的路徑里發(fā)揮著重要作用［6］。此外蟾蜍靈可以使HL－60細(xì)胞中拓?fù)洚悩?gòu)酶（Top）中mRNA及蛋白水平下降，最終引起凋亡［2－3］。蟾蜍靈還可以增加化療敏感性及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用。Efferth等［7］的研究表明在白血病多藥耐藥CEM／VLB100和CEM／E1000細(xì)胞中，蟾蜍靈可以明顯增加阿霉素的聚集，蟾蜍靈單一用藥對MDR白血病細(xì)胞的活性有明顯抑制作用，同阿霉素聯(lián)合用藥可以調(diào)節(jié)MDR白血病細(xì)胞的活性。Zhang等［8］的研究顯示蟾蜍靈與全反式維甲酸、VP－16或γ－干擾素等聯(lián)合應(yīng)用對 HL－60、U937和ML－1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化具有協(xié)同作用。華蟾酥在我國從20世紀(jì)70年代開始應(yīng)用于臨床，大量研究表明可以縮小腫瘤病灶，提高患者的生存率及生活質(zhì)量，且毒副作用較低［9］。作為華蟾酥主要活性成分之一，蟾蜍靈的臨床應(yīng)用必然具有巨大前景。

本實驗研究表明蟾蜍靈對K562細(xì)胞具有生長抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，為劑量依賴性，在小劑量時如0．025μmol／L，同伊馬替尼具有較強協(xié)同作用（P值接近0．05），隨著伊馬替尼的濃度的增加，對K562細(xì)胞的抑制率并不增加反而有下降趨勢，實驗濃度梯度較大及重復(fù)次數(shù)較少可能是未得到統(tǒng)計學(xué)意義的原因，有關(guān)機理尚需進一步研究。伊馬替尼價格較為昂貴，且副作用較多，一部分患者出現(xiàn)耐藥或不能耐受藥物毒副作用而停藥。蟾蜍靈的應(yīng)用有可能減少慢粒患者伊馬替尼的用量及增加其敏感性，為慢粒患者帶來益處。

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