大鼠肝臟在四氯化碳作用下NF－κB與CXCR1表達的研究

肝纖維化是肝病的典型表現形式，作為機體的自我保護作用，是生物體抵抗損傷所進行的一種反應。但是在疾病進程中，如果肝纖維化不能得到有效控制，在患者有可能發展為肝硬化。治療肝纖維化最有效的方法，除清除病毒，減少肝細胞損傷外，比較關鍵的是扭轉纖維化，恢復肝臟正常結構及功能。因而，導致肝纖維化的分子機制的研究便凸顯出積極的意義。但是研究發現，無論是靜止期還是活動期，肝星狀細胞（HSC）能夠被誘導產生趨化因子。靜止型HSC能夠被腫瘤壞死因子TNF所誘導，從而表達MCP－1，同時在氧化應激和脂質過氧化產物的作用下，活化型HSC能夠表達其他類型的趨化因子［1］。NF－κB和趨化因子在炎癥反應中起著重要的作用，有大量的證據表明趨化因子及其受體在造血、血管生成、惡性腫瘤、HIV的侵染、炎癥反應中起著重要的作用。然而，它們也在肝纖維化的發生中起到推波助瀾的作用。但是它們在肝損傷后經歷怎樣的變化，目前還不是很清楚。本文就大鼠肝臟在四氯化碳損傷后研究NF－κB與CXCR1表達的變化，以期為臨床治療肝纖維化提供理論依據。

材料與方法

1 實驗對象與分組 11周齡雄性健康SD大鼠30只，體重約為200g左右（購自交大醫學院實驗動物中心）。隨機分為對照組，實驗組兩組。各組大鼠在相同的濕度、溫度、光照條件下飼養進行適應性1周后，實驗組使用植物油配置的50%四氯化碳溶液腹腔注射，對照組直接腹腔注射植物油，每周1次，共計9周。分別在第3周，第6周，第9周隨機從兩組中各取出5只進行病理、分子生物學方面的檢查。

2 組織病理學檢測 分別在第3周，第6周，第9周取材，采用10%水合氯醛（3．5mg／kg）腹腔注射，麻醉大鼠。取肝臟組織，常規石蠟包埋，切片，HE染色。照相顯微鏡觀察并記錄。

3 RT－PCR檢測 取在液氮中保存的組織，加適量液氮研磨組織，再加入RNA提取液Trizol（1ml／50～100mg組織），繼續研磨至勻漿形成。總RNA的量檢測以RNA OD值計算，加入的量為1000ng的總RNA。普通PCR儀進行逆轉錄反應。GAPDH：上游：5′－CACGGCAAGTTCAATGGCACA－3′，下 游：5′－GAATTGTGAGGGAGAGTGCTC－3′；NF－κB：上游：5′－CACCACGCTCTTCTGTCTACTGAAC－3′，下游：5′－CCGGACTCCGTGATGTCTAAGTACT－3′；CXCR1：上 游：5′－TTGGAAATATCACCCGAATGCTG－3′， 下 游： 5′－AAGATGGCAAAAGGCAGAGAC－3′。95℃預變性結束后，進行2步PCR循環，并檢測熒光信號，95℃變性5s，60℃復性延伸45s，重復40個循環。以上程序結束后，分析溶解曲線，確定產物的溶解溫度，95℃完全變性10s，60℃進行復性30s，然后再升溫到90℃15s，檢測完畢。分析運行結果，分析并觀察樣本的Ct值。依據結果采用待測基因的拷貝數與內參GAPDH基因的拷貝數的比值來表示目的基因的相對表達量。

4 Western blot檢測 用預冷的蛋白裂解液［含125mmol／L Tris－HCl，5% （w／v）SDS，24．75%甘油］裂解肝組織，作用時間為30min，待裂解結束后，組織勻漿移到無菌離心管，離心12000rpm，4℃，共計20 min。棄沉淀，將上清液。加入蛋白上樣緩沖液于蛋白樣品（4︰1），用水煮沸8min。低溫冷凍離心機上離心，12000rpm，4℃，10min，取上清液。按照試劑盒的介紹方法，用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白的濃度進行檢測。每孔總蛋白上樣量30μg，10%SDS聚丙烯纖胺凝膠電泳2h，后轉至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2h，用封閉液稀釋一抗（NF－κB和CXCR1）到適宜濃度，將稀釋的抗體加入到平皿中，用濾紙吸凈從封閉液取出的PVDF膜表面的液體，吸干后膜覆蓋在稀釋后的抗體上，4℃過夜。抗體孵育結束后，倒掉抗體，PBST洗脫膜，每次15min，共3次。同法加入二抗，用PBST洗完之后，進行化學發光反應。β－actin作為內參。

5 統計學處理 采用SPSS10．0統計軟件進行數據分析，數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0．05表明差異有統計學意義。

結 果

1 病理學觀察 見圖1。與正常對照組相比，四氯化碳注射組隨著時間的延長，大鼠的生活狀態發生變化，飲食不振，精神萎靡等。在病理圖片中，隨著時間的延長，實驗組大鼠的肝臟逐漸發生腫脹現象，和正常組相比，顏色由鮮紅變為暗紅色，最后，變為淺灰色，同時肝臟的體積發生萎縮現象，體積變小，同時伴隨著肝臟質地變硬。從病理圖片上還能發現，隨著造模時間的延長，出現肝細胞水腫，輕度的脂肪變化，肝細胞點狀、灶狀壞死，炎癥細胞增多，細胞間纖維增生。

圖1 四氯化碳對大鼠肝臟的影響

2 四氯化碳對大鼠肝臟NF－κB和CXCR1mRNA表達的影響 對照組、四氯化碳處理組在3周、6周、9周組中肝臟NF－κB的mRNA相對表達量分別為：8．27×10－5，9．14×10－5，9．62×10－5，2．34×10－4；CXCR1的相對表達量分別為：8．07×10－4，1．78×10－3，2．98×10－3，4．27×10－3，可見四氯化碳處理9周組NF－κB和CXCR4的表達量顯著的高于對照組，其中的NF－κB升高最為明顯（圖2～5）。

圖2 NF－κB的擴增曲線

圖3 CXCR1的擴增曲線

圖4 不同處理組肝臟組織中NF－κB mRNA的相對表達水平變化

3 四氯化碳對大鼠肝臟NF－κB、CXCR1蛋白表達水平的影響 經過對免疫印跡結果進行灰度掃描，采用相應的軟件分析后，經過計算發現正常對照組、四氯化碳處理3周組、6周組、9周組肝臟中NF－κB的蛋白相對表達量分別為：0．13±0．02、0．12±0．03、0．29±0．01、0．58±0．02；CXCR1的相對表達量表達量分別為：0．19±0．05、0．29±0．02、0．41±0．03、0．58±0．06。四氯化碳處理組，NF－κB和CXCR1的表達量都明顯高于正常對照組。

圖5 不同處理組肝臟組織中CXCR1mRNA的相對表達水平變化

討 論

從上述結果可以看出，與對照組相比，四氯化碳處理組中NF－κB與CXCR1在肝臟中的表達無論是在mRNA的核酸水平上還是在蛋白水平上都呈現升高的趨勢，雖然升高的程度有所差別，尤其是在四氯化碳處理組中的第9周組表現最為明顯。通過比較發現發現NF－κB在肝臟損傷中的表達量升高的趨勢明顯比趨化因子受體CXCR1升高的快。大鼠肝臟在四氯化碳刺激下，大鼠肝臟中的NF－κB與CXCR1的表達量隨著四氯化碳的作用時間延長而呈現出升高趨勢，在兩者共同作用下，同時在其他的炎癥因子或者炎癥抑制因子的共同作用下，在肝臟受到損傷時，起到積極的保護作用。

研究發現，當大鼠的肝細胞在CCl4的刺激下，在細胞中能夠產生單核細胞趨化蛋白－1（MCP－1），而且該因子被證實主要在HSC中表達［2］。HSC在趨化因子的作用下，參與了肝組織損傷和修復的一系列反應，在肝慢性炎癥和纖維化形成中發揮著重要的作用。大量的研究證實，炎癥不僅是與慢性肝病聯系密切，同時他還能極促進疾病進展［3－5］。大于80%的肝癌患者伴隨著發生肝硬化或纖維化，從而在慢性肝細胞損傷、再生，炎性細胞的滲透作用和活化的肌成纖維細胞的豐度方面有這一定的發展［6］。

NF－κB在不同的細胞組成中具有廣泛的功能，能夠影響肝細胞的存活，枯夫細胞的炎癥反應以及造血干細胞細的存活，炎癥反應及細胞活性。NF－κB在肝臟中所擔負的關鍵角色已被證實，通過基因敲除小鼠模型中的一些NF－κB調節因子，從而導致肝臟的自發性肝損傷，肝纖維化和肝癌。該研究不僅能夠突出NF－κB在肝臟疾病過程的重要作用，同時也能夠揭示也強調肝損傷，炎癥，纖維化和肝癌之間潛在的分子機制。

肝纖維化是不同致病因素導致的慢性肝損傷的結果。雖然肝纖維化通常在停止傷害后反轉，但是如果這種病得不到及時治療，任其繼續發展，最終會導致肝硬化，這種情況通常是無法改變的［6］。多種炎癥介質基因的啟動子和增強子中存在一個或多個κB序列，如 TNF－α、IL－1、IL－2、IL－6、IL－8、G－CSF、GM－CSF、ICAM－1、VCAM－1（血管細胞粘附分子）、ELAM－1（內皮細胞白細胞粘附分子）等。活化的NF－κB則參與它們的基因表達，引起多種細胞因子的表達增高，參與調節免疫反應及炎癥過程。NF－κB調節肝纖維化的發生主要是通過三個不同的方面來進行：①通過對損傷的肝細胞進行調節，對肝臟纖維化做出一定的響應；②通過調節炎癥信號通路，激活肝臟中的巨噬細胞和其他炎癥細胞；③通過調節造血干細胞中的纖維化反應。綜上所述，NF－κB活性在肝臟中的減少或缺失致肝細胞損傷和隨后的纖維化程度的增加。在本實驗中，通過四氯化碳作用引起大鼠肝損傷，從病理切片中能夠明顯的觀察到相關的現象，同時通過在核酸和分子水平上進行檢測，發現NF－κB和趨化因子受體的表達水平上都發生變化，雖然變化程度不一樣，但是通過統計學分析，兩者呈正相關性。

白介素－8受體α是趨化因子受體，主要表達在免疫細胞，包括中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞以及上皮細胞、成纖維細胞等結構細胞表面上。是具有7次跨膜域的受體，屬G蛋白偶聯受體（GPCR）超家族成員，與配對的趨化因子結合，通過G蛋白變構激活下游的效應分子進行信號轉導，實現生物學功能。按照結構可分為CXCR、CCR、CR和CX3CR四個亞類。CXCR1是CXCR家族的主要成員之一，主要表達于中性粒細胞、單核細胞、T細胞等細胞表面，在多種炎癥性疾病中發揮重要作用。此外，該受體激活可以調節細胞發育、血管生成等作用。Murdoch等［7］研究發現，在HBV導致肝硬化患者，病毒除導致肝細胞壞死誘發炎癥因子大量產生，并且誘導受染肝細胞及血管內皮細胞等大量分泌IL－8，CXCR1作為IL－8受體，其可能參與乙肝慢性化及肝硬化疾病進程。王健等［8］研究也提示HBV感染后肝硬化患者外周血CXCR1mRNA表達上調。推測CXCR1在參與HBV介導的致炎分子作用。通過控制HBV復制或阻斷CXCR1表達可使肝硬化患者炎性反應減輕，阻止或延緩纖維化的發生。本研究結果也表明，在四氯化碳引發肝細胞損傷后，CXCR1的表達無論是基因水平還是蛋白水平均提高，并且隨著損害時間的延長，其表達進一步增高，因而可以認為其參與損傷后的修復，進而導致后期肝纖維化的發生。

綜上所述，當肝臟受到損傷后，大鼠體內的NF－κB和CXCR1無論是基因還是蛋白均增高，可見兩者都參與了大鼠的肝臟損傷保護或者加重肝纖維化，為進一步揭示肝臟在損傷條件下的肝纖維化機制提供了積極的理論基礎，同時為治療肝臟損傷所引起的一系列疾病提供了一種手段，為研究新型藥物治療肝損傷提供一定的理論依據。

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［8］ 王 健，畢惠娟．肝硬化患者外周血CXCR1、CXCR2表達及其與血清ALT、AST水平的相關性［J］．中國病原生物學雜志，2012，7（11）：823－827．