脫酚葡萄籽粉發酵液抗氧化活性研究

王臣東，劉文明，王 婷，田繼霞，李彩霞，焦 揚

(河西學院農業與生物技術學院，甘肅張掖734000)

葡萄酒生產過程中會產生大量的副產物如葡萄籽、葡萄皮。目前，對葡萄籽成分的開發利用主要為葡萄籽油、多酚類物質，而對葡萄籽蛋白質的利用極少。葡萄籽中含有11%～13%的蛋白質。與蛋白質相比，活性肽不僅有比蛋白質更好的消化吸收性能，還具有多種生理功能，如:抗氧化、降血壓、調節血脂水平、提高免疫力、促進礦物質的運輸和吸收等［1-2］。目前，生產多肽的方法主要有酸解法［3］、酶解法［4］、生物發酵法［5］。與酶解法相比，發酵法的優勢是能將微生物產酶和酶水解兩步合一，省去酶的分離和提純步驟，減少生產工藝，降低成本。葡萄籽中含有大量多酚類物質，且多酚類物質易與蛋白質發生結合沉淀。本文以經堿液浸泡脫酚處理后的葡萄籽為原料，采用產胞外堿性蛋白酶的菌株地衣芽孢桿菌(bacillus licheniformis)培養發酵，比較了不同處理方式對脫酚葡萄籽粉發酵液多酚和多肽量的影響，并考察了發酵液對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH 自由基的清除效果。以期為葡萄籽蛋白的利用提供理論依據，進一步為葡萄籽的綜合利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄籽 由甘肅張掖國風葡萄酒業有限公司提供;地衣芽孢桿菌30203(bacillus licheniformis) 購于甘肅省微生物保藏中心;斜面培養基 LB 固體培養基;種子培養基 蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.5%，葡萄糖1.0%，磷酸氫二鉀0.5%，硫酸鎂0.02%;產酶培養基 酵母浸粉0.2%，糊精0.6%，磷酸氫二鉀0.2%，氯化鈣0.06%，干酪素0.2% 所用藥品均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄籽粉處理方式

1.2.1.1 萄萄籽脫酚方法 參照文獻［6］，將葡萄籽從釀酒后葡萄皮渣中分離，用0.05mol/L NaOH 固液比1∶10 浸泡，80℃水浴浸泡30min，重復三次，清水沖洗葡萄籽，干燥，粉碎過40 目篩，即得到脫酚葡萄籽粉。采用凱氏定氮法測得總蛋白含量12.65%，65℃恒重法測得水分含量10.5%。

1.2.1.2 地衣芽孢桿菌培養方法 將斜面保存的地衣芽孢桿菌轉接在平板上，培養24h 后，將單菌落接入裝液量20mL/100mL 的種子培養液中，于32℃，150r/min，振蕩培養14～16h，使菌濃OD600達到1.2～1.5 之間。將種子液以10% 接種量接入裝液量60mL/250mL 的產酶培養基中，于34℃，150r/min，振蕩培養8h，得地衣芽孢桿菌和堿性蛋白酶(酶量為180～210U/mL)混合液。

1.2.1.3 葡萄籽粉液制備方法 將地衣芽孢桿菌和堿性蛋白酶混合液以50%的比例加入固液比1 ∶12的葡萄籽粉液中，于34℃，150r/min，振蕩培養，得到葡萄籽粉發酵液。以葡萄籽粉液不接菌僅加入等量滅菌蒸餾水為參比Ⅰ，葡萄籽粉液接入等量種子菌液為參比Ⅱ，葡萄籽粉液加入等量的滅菌產酶培養液為參比Ⅲ。

1.2.2 多酚測定方法 采用Folin-Ciocalteu 比色法［7］測定提取液中的多酚含量。

1.2.3 多肽含量測定

1.2.3.1 標準曲線的制作 參考文獻［8］，用5%的TCA 配制0.3mg/mL 的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標準溶液，分別取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 加蒸餾水至6.0mL，然后加入4.0mL 雙縮脲試劑，于漩渦混合儀上混合均勻，于2000r/min 離心10min，取上清液測定A540值。以多肽的含量為縱坐標C(mg)，A 值為橫坐標，制作標準曲線，得回歸方程:

1.2.3.2 樣品中多肽含量測定 取2.0mL 葡萄籽粉液，加入2.0mL 10%(W/V)的TCA 水溶液，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10min，然后在4000r/min下離心15min，取上清液3.0mL，加入雙縮脲試劑2.0mL，于漩渦混合儀上混合后，2000r/min 離心10min，取上清液于540nm 下測定OD 值，對照標準曲線回歸方程，求得樣品溶液中多肽含量C(mg)。

一次澆筑實際體積相對較大，而斷面卻很小，底板厚度可達95cm，兩側厚度也超過200cm，為局部大體積混凝土，為避免卡開裂，應做好溫度控制。在施工過程中，應密切留意入模溫度與澆筑速度，在必要的情況下采用摻加冰塊的方法進行降溫。在完成澆筑后，應及時進行覆蓋與灑水養護。

1.2.4 抗氧化活性測定

1.2.4.1 對羥自由基(·OH)的清除率 利用H2O2與FeSO4混合產生·OH，在體系內加入水楊酸能有效地捕捉·OH 并產生有色物質，該物質在波長510nm 處有最大吸收［9］。

在10mL 的試管中依次加2mL 6mmol/L 硫酸亞鐵溶液，2mL 6mmol/L 水楊酸溶液和2mL 葡萄籽粉液，混合均勻后，加2mL 6mmol/L 雙氧水溶液啟動反應，于37℃恒溫反應30min，以蒸餾水為參比，考慮到樣品本身的吸光值，不加顯色劑雙氧水得到本底吸光值。對羥自由基(·OH)的清除效率可根據下式進行計算:

式中:A0-為未加發酵液的空白對照值，Ai-加發酵液的測定值，Aj-為本底吸收值。

1.2.4.2 對超氧陰離子的清除率 采用了鄰苯三酚自氧化法［10］。取4.5mL pH8 的2.5mmol/L Tris-HCl緩沖溶液，1.0mL 葡萄籽粉液，2.4mL 蒸餾水，混勻后在25℃水浴中保溫20min，取出后立即加入在25℃預熱過的3mmol/L 的鄰苯三酚0.1mL，迅速搖勻后倒入比色杯，于325nm 下每隔30s 測定吸光度，計算線性范圍內每分鐘吸光度的增加。計算抑制率。

式中:ΔA0為鄰苯三酚的自氧化的速率;ΔAi為加入樣液溶液后鄰苯三酚自氧化的速率。

1.2.4.3 對DPPH 自由基的清除率 參照文獻［11］稍作修改，將0.1mL 葡萄籽粉液于0.4mL 100mmol/L Tris- HCl(pH8.2)混勻后，加入2.0mL 0.2mmol/L DPPH 乙醇溶液，搖勻，在暗處放置30min，測定517nm 波長處的吸光度Ai，以2.0mL70%乙醇為參比的本底吸光值，空白對照組以2.0mL 無水乙醇代替樣品。DPPH 自由基清除率按以下公式計算。

式中:A0-為空白對照吸光值，Ai-為樣液的吸光值，AJ-為參比的本底吸光值。

1.2.5 數據處理 每個處理做3 次重復，以平均值±標準偏差反映各指標的大小。Origin Lab7.5 軟件進行數據作圖。

2 結果與討論

2.1 處理方式對脫酚葡萄籽粉液多肽含量的影響

地衣芽孢桿菌屬(B.licheniformis)微生物是目前工業用于發酵生產堿性蛋白酶的主要菌種。多數微生物所產堿性蛋白酶，具有水解蛋白脂鍵、酰胺鍵和轉脂及轉肽的能力。在大豆蛋白加工業中，用堿性蛋白酶改性大豆蛋白，可以提高其保健功能。實驗用地衣芽孢桿菌30203 菌株所產蛋白酶為胞外酶。采用先培養地衣芽孢桿菌使其菌體繁殖和產堿性蛋白酶達一定程度后，加入一定固液比的脫酚葡萄籽粉，考察發酵時間和不同處理方式下發酵液中多肽變化。結果如圖1 所示。

由圖1 可見，隨時間變化，未接入菌液的參比Ⅰ和參比Ⅲ多肽含量的變化不明顯，基本在1.19 ～1.42g/L。參比Ⅱ在前24h 內多肽含量和參比Ⅰ基本持平在1.23g/L 左右，而24h 以后多肽含量明顯增加至2.60g/L。對脫酚葡萄籽發酵液而言，時間對其多肽含量影響較明顯。在24h 內發酵液多肽含量即達到2.35g/L 左右，隨時間延長多肽含量增大，在72h即達到最大值4.23g/L，之后多肽量基本保持不變。由此可見，未接入菌液的參比Ⅰ和參比Ⅲ處理方式下，多肽含量較低，接菌處理后可以明顯提高多肽含量，并以先培養菌株使其繁殖和產堿性蛋白酶達到一定程度后，加入一定固液比的脫酚葡萄籽粉的處理方式下得到多肽的量最大。

圖1 處理方式對脫酚葡萄籽粉液中多肽濃度的影響Fig.1 The influence of processing mode on peptides concentration of grape seed powder removed phenolic solution

2.2 處理方式對葡萄籽粉液多酚含量的影響

對一定固液比的脫酚葡萄籽，設置不同處理方式的pH 為8.0。考察了不同處理方式下多酚的變化。結果如圖2 所示。

圖2 處理方式對脫酚葡萄籽粉液中多酚濃度的影響Fig.2 The influence of processing mode on polyphenol concentration of grape seed powder removed phenolic fluid

由圖2 可見，參比Ⅰ和參比Ⅲ的多酚含量相當，在60mg/L 左右，且隨時間延長多酚含量有降低趨勢。參比Ⅱ和發酵液的多酚含量，隨發酵時間延長，多酚含量先增加后又降低，在72h 分別達到最大量80.74、128.83mg/L。由此可見，葡萄籽整粒脫酚磨粉后以堿性條件(pH8.0)處理，還是有一定量的殘余多酚類物質，而且通過地衣芽孢桿菌的發酵和堿性蛋白酶的作用，葡萄籽粉組織內的多酚類物質會釋放出來，但隨時間延長，多酚類物質可能發生了氧化或與蛋白共沉作用而有所降低。

2.3 葡萄籽粉液的抗氧化活性

2.3.1 脫酚葡萄籽粉液對羥自由基的清除作用 ·OH是最活潑的氧自由基，對生物體危害較大，可與活細胞中的任何分子發生反應而對機體造成損傷［12-13］。考察了不同處理方式的葡萄籽粉液對羥自由基的清除作用。結果如圖3 所示。

由圖3 可見，四種處理方式下脫酚葡萄籽粉液對羥自由基的清除作用差異顯著。相對來說發酵液最好，參比Ⅱ次之，而參比Ⅰ最差其清除率在20%左右。且對羥自由基的清除效果的趨勢與多肽量變化圖1 很相似，但隨時間延長，清除率降低。可能的原因有二:其一，堿性蛋白酶作用于脫酚葡萄籽粉后其水解得到的多肽組成可能為多種肽片段，且對羥自由基的清除不呈量效關系［14］。其二，在對羥自由基的清除作用中，多肽和多酚可能相互作用，而減弱了清除效果。結合圖1 和圖2 可得，在實驗的處理方式下，脫酚葡萄籽粉液對羥自由基的清除效果主要由堿性蛋白酶水解得到的多肽類物質起作用，而且可能得到的是不同分子量大小的多肽類物質［5，14］。

圖3 脫酚葡萄籽粉液對羥自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effect to hydroxy free radical of grape seed powder removed phenolic fluid

2.3.2 脫酚葡萄籽粉液對超氧自由基的清除作用超氧陰離子自由基是生命代謝過程中產生的一種重要的自由基，具有很強的氧化能力。考察了不同處理方式的葡萄籽粉液對超氧陰離子自由基的清除作用。結果如圖4 所示。

圖4 脫酚葡萄籽粉液對超氧陰離子自由基的清除效果Fig.4 Scavenging effect to superoxide free radicals of grape seed powder removed phenolic fluid

由圖4 可見，不同處理方式下脫酚葡萄籽粉液對超氧自由基的清除率的差異不顯著，參比Ⅰ和參比Ⅲ的清除率相當，在50%左右，參比Ⅱ對超氧自由基的清除率最大值為57.35%，而脫酚葡萄籽粉發酵液對超氧自由基的清除率最大為72.76%。楊碧霞等［15］研究表明，葡萄籽多肽對羥基自由基和超氧自由基的清除能力差異明顯，當蛋白酶酶解后等電點沉淀的多肽濃度達8g/L 時，對兩者的清除率分別為93.10%和42.79%。結合圖1 可得，堿性蛋白酶水解脫酚葡萄籽粉得到的多肽類物質對超氧自由基的清除作用不明顯，而葡萄籽粉液的自身水溶性物質，如水溶性較好的低聚合度的原花青素［16］、白藜蘆醇［17］等在清除超氧陰離子自由基方面發揮著主要作用，但堿性蛋白酶和地衣芽孢桿菌對葡萄籽粉的作用使其對超氧自由基的清除效果提高了約20%。

2.3.3 脫酚葡萄籽粉液對DPPH 自由基的清除作用 DPPH·是一種穩定的含氮自由基，當待測物質含有抗氧化物時，抗氧化物提供一個電子與其配對結合，使DPPH·的特征紫色消失，根據褪色程度的大小來評價抗氧化劑的抗氧化性［18］。考察了不同處理方式的葡萄籽粉液對DPPH 自由基的清除作用。結果如圖5 所示。

圖5 脫酚葡萄籽粉液對DPPH 自由基的清除效果Fig.5 Scavenging effect to DPPH free radicals of grape seed powder removed phenolic fluid

由圖5 可見，時間對不同處理方式下脫酚葡萄籽粉液對DPPH 自由基的清除率影響不顯著，且每種處理方式下的清除率均很穩定。而且參比Ⅰ對DPPH 自由基的清除效果最差，清除率約為35%左右，參比Ⅲ的清除率約為40%，而參比Ⅱ和發酵液對DPPH 自由基的清除率相對較高分別為61.91% 和85.11%。結合圖1、圖2 可知，堿性蛋白酶水解葡萄籽粉得到的多肽類物質可能是清除DPPH 自由基的主要物質之一，但脫酚葡萄籽粉水溶性成分以及通過堿性蛋白酶和地衣芽孢桿菌發酵后的非多肽類物質的作用也不能忽視。

3 討論與結論

孫蕓等［16］認為，葡萄籽原花青素對DPPH·的清除作用與聚合度無關，對·OH 和超氧陰離子自由基的清除能力隨著聚合度的升高而下降。張玲［19］認為，小麥蛋白的酶解多肽類物質對DPPH·、羥基和超氧陰離子自由基的清除能力隨多肽分子量的減小而增加，隨多肽濃度的增加而增加，分子量小于3000u 的肽片段抗氧化效果最好。鄧成萍［20］等人研究了大豆蛋白酶解產物不同分子量肽段的抗氧化性也得到類似的結論。實驗中對發酵液采用凝膠電泳定性測定了多肽類物質的分子量范圍，在小于21ku 有多條條帶。可推測，本研究脫酚葡萄籽粉發酵液清除自由基的差異與發酵液中肽段的分子量偏大以及脫酚后殘余原花青素的聚合度有關。但具體原因還有待于進一步研究。

由此，先培養地衣芽孢桿菌使其繁殖和產堿性蛋白酶達到一定程度后，加入一定固液比的脫酚葡萄籽粉的處理方式，得到多肽量最大為4.23g/L。而且通過地衣芽孢桿菌發酵和堿性蛋白酶的作用，葡萄籽粉組織內的多酚類物質會釋放出來，最高可達128.83mg/L，但隨時間延長，多酚類物質量有所降低。脫酚葡萄籽粉水解后的多肽類物質對羥自由基和DPPH 自由基的清除起關鍵作用，而且可能得到的是不同分子量的多肽物質，不同片段的多肽物質對自由基的清除效果不同。脫酚葡萄籽粉中的原花青素以及白藜蘆醇等成分在清除超氧陰離子自由基方面發揮主要作用，但堿性蛋白酶和地衣芽孢桿菌對葡萄籽粉的作用使其對超氧陰離子自由基的清除效果提高了約20%。

［1］張美莉，侯文娟，楊立風.植物蛋白源生物活性肽的研究進展［J］.中國食品與營養，2010(11):34-36.

［2］張莉莉，嚴群芳，王恬，等.大豆生物活性肽的分離及抗氧化活性的研究［J］.食品科學，2007，28(5):208-211.

［3］Folawiyo Y L，Owusu Apenten R K.The effect of heat and acid treatment on the structure of rape seed albumin(napin)［J］.Food Chemistry，1997，58(3):237-243.

［4］Chabanon G，Chevalot I，Framboisier X，et al.Hydrolysis of rapeseed protein isolates:Kinetics characterization and functional properties of hydrolyates［J］.Process Biochemistry，2007，42:1419-1428.

［5］邱鑫，肖漢乾，向天勇，等.菜籽餅粕粗蛋白降解菌的篩選、初步鑒定與發酵條件摸索［J］.氨基酸和生物資源，2005，27(1):1-5.

［6］葉潤，牟德華.葡萄籽中多酚類物質的脫除及蛋白質提取實驗研究［J］.食品研究與開發，2009，30(12):45-48.

［7］Rambourg J C，Monties B. Determination of polyphenolic compounds in leaf protein concentrates of lucerne and their effect on the nutritional value［J］.Plant Foods for Human Nutrition，1983，33(2):169-172.

［8］魯偉，任國譜，宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的測定方法［J］.食品科學，2005，26(7):169-171.

［9］王永寧，石玉平，郭珍，等.沙棗花中黃酮類化合物對羥基自由基的清除研究［J］.青海醫學院學報，2003，24(4):281-283.

［10］程超，李偉，汪興平.平菇水溶性多糖結構表征與體外抗氧化作用［J］.食品科學，2005，26(8):55-56.

［11］Liu X L，Cui Ch，Zhao M M，et al.Identification of phenolics in the fruit of emblica (Phyllanthus emblica L.)and their antioxidant activityes［J］.Food Chemistry，2008，109 (4):905-915.

［12］熊何健，吳國宏，王莉芳，等.山竹多酚的分離制備及清除自由基活性研究［J］.河南工業大學學報:自然科學版，2010，31(5):25-29，70.

［13］Pena-Ramos E A，Xiong Y L.Antioxidantive activity of whey protein hydrolysates in a liposomal system［J］.Journal of Dairy Science，2001，84(12):2577-2583.

［14］郭紅英.麥胚蛋白酶解物的制備及其抗氧化性研究［D］.鎮江:江蘇大學，2009.

［15］楊碧霞，馮翠萍，張碩，等.葡萄籽多肽的制備及功能研究［J］.山西農業大學學報:自然科學版，2010，31(6):551-556.

［16］孫蕓，徐寶才，谷文英，等.葡萄籽原花青素聚合度與自由基清除能力關系的研究［J］.食品科學，2007，28(12):423-428.

［17］鐘耕，陳宗道，閡燕萍.葡萄籽和皮中黃酮成分和抗氧化能力研究［J］.西南農業大學學報:自然科學版，2005，27(1):64-68.

［18］李姣娟，周盡花，戴瑜，等.川桂葉總黃酮清除DPPH 自由基作用的研究［J］.中南林業科技大學學報，2011，30(10):125-128，132.

［19］張玲.小麥面筋多膚的分離純化及抗氧化活性測定［D］.鎮江:江蘇大學，2010

［20］鄧成萍，薛文通，孫曉琳，等.不同分子量段大豆多肽功能特性的研究［J］.食品科學，2006，27(5):109-112.