響應(yīng)面優(yōu)化三氯乙酸沉淀測(cè)定豆醬游離氨基酸中蛋白質(zhì)

張 苗，武俊瑞，代金月，邱小玉，岳喜慶*

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

豆醬(soybean paste)是我國(guó)四大傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品之一，它是以大豆為主要原料制成的醬，經(jīng)自然發(fā)酵而成的半流動(dòng)狀態(tài)的發(fā)酵食品，也稱黃豆醬、黃醬或大豆醬[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬具有獨(dú)特的風(fēng)味，豆醬具有獨(dú)特的風(fēng)味，其風(fēng)味是由釀造過(guò)程中微生物引起的生物化學(xué)反應(yīng)形成的。把原料中的不溶性高分子物質(zhì)，分解成低分子化合物，這些物質(zhì)的相互結(jié)合形成了種類繁多的呈味物質(zhì)[2]。這些呈味物質(zhì)主要是氨基酸。因此豆醬中氨基酸的種類和數(shù)量決定了豆醬的品質(zhì)，分析其含量和數(shù)量就顯得尤為重要。

氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)所進(jìn)樣品要求很嚴(yán)格，需要所進(jìn)樣品除去有機(jī)酸、脂肪、蛋白等物質(zhì)。雖然樣品溶解在水中后，游離態(tài)氨基酸可溶解在水中，但非水解樣品溶液中的部分水溶性蛋白經(jīng)過(guò)高速離心仍無(wú)法除去，因此需選用蛋白沉淀劑除去經(jīng)高速離心后仍無(wú)法去除的水溶性蛋白[3]。三氯乙酸(TCA)沉淀法原理是：TCA作為蛋白質(zhì)變性劑可使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水基團(tuán)，使之聚集沉淀[4]。本研究利用蛋白質(zhì)遇TCA產(chǎn)生沉淀的特點(diǎn)，結(jié)合雙縮脲比色法測(cè)其含量[5]，以此為指標(biāo)來(lái)確定TCA沉淀測(cè)定豆醬游離氨基酸中蛋白的最佳實(shí)驗(yàn)條件，為氨基酸含量測(cè)定提供簡(jiǎn)便可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆醬，采自當(dāng)?shù)剞r(nóng)家自制的傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬，樣品保存于密封袋中，4℃冷藏備用。

酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(生化試劑，純度≥99%) 北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；三氯乙酸(TCA)、氫氧化鉀溶液、酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)、硫酸銅(CuSO4·5H2O)、95%乙醇、四氯化碳(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、茚三酮 德國(guó)Sykam公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；磺酸型陽(yáng)離子樹脂分離柱(4.6mm×60mm，3μm) 日本Hitachi公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR22GⅡ/CR21GⅡ日立高速冷凍離心機(jī) 日立工機(jī)株式會(huì)社本社工廠；KQ-500DB型超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；UV-5100B紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品干燥

樣品在恒溫干燥箱中55℃烘干至恒質(zhì)量。

1.3.2 三氯乙酸沉淀蛋白與雙縮脲比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[6-11]

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

準(zhǔn)確稱取10、20、30、40、50、60mg酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別置于6個(gè)50mL離心管內(nèi)，各加入20.0mL雙縮脲試劑，搖勻。靜置10min后，以雙縮脲試劑調(diào)零，540nm波長(zhǎng)處測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以吸光度(y)為縱坐標(biāo)，以酪蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.1759x＋0.0023，r2=0.9994。

1.3.2.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

稱取1g研磨均勻的豆醬干粉，加入8g/100mL TCA溶液，再充分研磨混勻轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，25℃水浴條件下超聲30min，10000r/min離心10min，傾去上清液，沉淀用95%乙醇10mL洗滌。向沉淀中加入四氯化碳2mL和雙縮脲試劑20mL，置于超聲波清洗器中振蕩均勻，靜置顯色10min，在10000r/min離心20min，取上層清液，540nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。試樣中蛋白質(zhì)含量以ρ(g/100g)表示，結(jié)果按下式計(jì)算，實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。

式中：m0為取樣量/mg；A540nm為測(cè)得的吸光度。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別考察沉淀劑TCA質(zhì)量濃度、沉淀溫度、離心轉(zhuǎn)數(shù)3個(gè)因素對(duì)前處理中蛋白質(zhì)沉淀效果的影響，以蛋白質(zhì)含量為評(píng)定指標(biāo)。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 One-factor-at-a-time design

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定各因素的取值水平范圍，結(jié)合Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，分別選取TCA質(zhì)量濃度(A)、沉淀溫度(B)、離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)(C)作為自變量，以蛋白質(zhì)含量作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。利用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)沉淀蛋白質(zhì)的最佳條件。

1.3.5 游離氨基酸測(cè)定

稱取研磨均勻的豆醬干粉1g，加入8.3g/100mL的TCA溶液，再充分研磨混勻轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，47℃溫度條件下超聲波超聲提取1h，1726r/min離心30min，取上清液2mL于蒸發(fā)皿中蒸干。加入2.5mL 0.02mol/L的鹽酸溶液溶解，經(jīng)0.22μm的濾膜過(guò)濾，作為待測(cè)液。

色譜條件[12]：色譜柱：磺酸型陽(yáng)離子樹脂分離柱(4.6mm×60mm，3μm)；梯度洗脫：循環(huán)時(shí)間53min，分離柱柱溫57℃，反應(yīng)柱柱溫135℃，緩沖液流速0.4mL/min，茚三酮流速0.35mL/min；通道1：檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，采集時(shí)間32min；通道2：檢測(cè)波長(zhǎng)440nm，采集時(shí)間10min；進(jìn)樣量20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

蛋白質(zhì)沉淀效果受T C A 質(zhì)量濃度、沉淀溫度和離心轉(zhuǎn)數(shù)影響，由圖1 可知，T C A 質(zhì)量濃度在2～10g/100mL時(shí)，測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量呈上升的趨勢(shì)，8g/100mL以后趨于平穩(wěn)，考慮到過(guò)高的TCA會(huì)對(duì)氨基酸檢測(cè)帶來(lái)影響，故選擇8g/100mL TCA質(zhì)量濃度。TCA質(zhì)量濃度從2～10g/100mL時(shí)，酸度逐漸增強(qiáng)，TCA在酸性條件下與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽，并作為蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水性基團(tuán)，使蛋白質(zhì)聚集沉淀[13]。此外，沉淀溫度對(duì)蛋白質(zhì)沉淀效果也存在影響，當(dāng)反應(yīng)溫度從25℃升至65℃時(shí)，蛋白質(zhì)含量增加不明顯，可見溫度對(duì)TCA沉淀蛋白質(zhì)作用影響不大，這與任國(guó)譜等[14]的報(bào)道是一致的。但隨溫度的提高，分子運(yùn)動(dòng)速率提高，蛋白質(zhì)沉淀速率加快，有助于縮短反應(yīng)時(shí)間，綜合考慮選擇溫度45℃。隨離心轉(zhuǎn)數(shù)的增加，蛋白質(zhì)含量呈上升的趨勢(shì)，16000r/min后趨于平穩(wěn)，當(dāng)離心轉(zhuǎn)數(shù)16000r/min，測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高值。

圖 1 TCA質(zhì)量濃度(a)、沉淀溫度(b)、離心轉(zhuǎn)數(shù)(c)對(duì)蛋白質(zhì)沉淀的影響Fig.1 Effect of three factors on protein precipitation

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化蛋白沉淀?xiàng)l件

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[15-17]，選擇TCA質(zhì)量濃度(A)、沉淀溫度(B)、離心轉(zhuǎn)數(shù)(C)，作為響應(yīng)面優(yōu)化的考察因素，每個(gè)因素取三水平，以(－1，0，1)編碼，以測(cè)定的蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)。試驗(yàn)因素及水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平Table 2 Variables and coded values for Box-Behnken design

應(yīng)用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，依次進(jìn)行試劑的配制，蛋白質(zhì)含量測(cè)定(每組3個(gè)平行)[18-19]，以樣品中蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken design

2.2.2 回歸模型的建立及統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)表3的試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)Design Expert 7.0軟件處理確定回歸方程，該試驗(yàn)的回歸方程為：Y=23.16＋0.33A＋0.32B＋0.43C＋0.23AB＋0.23AC＋0.25BC－1.43A2－0.95B2－0.83C2(1)

回歸模型進(jìn)行方差分析及可信度分析結(jié)果見表4。

表4 回歸方程的統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Statistical analysis of the fitted regression equation

由表4可知，TCA質(zhì)量濃度和沉淀溫度的二次項(xiàng)對(duì)蛋白質(zhì)沉淀效果影響均具顯著性(P＜0.01)，離心轉(zhuǎn)數(shù)和它的二次項(xiàng)對(duì)蛋白質(zhì)沉淀效果影響也具顯著性(P＜0.05)，其他變量影響均不顯著(P＞0.05)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)α=0.05顯著水平剔除不顯著項(xiàng)，簡(jiǎn)化后的回歸方程為：

根據(jù)表4可知，模型極顯著(P＜0.01)，因變量與自變量之間的線性關(guān)系顯著(R2=0.9445)，模型調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.8447，說(shuō)明該模型能解釋84.47%響應(yīng)值的變化，擬合程度較好。失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05)，說(shuō)明試驗(yàn)所得二次回歸方程能很好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)[20-21]。

2.2.3 蛋白沉淀?xiàng)l件的響應(yīng)面分析及優(yōu)化

圖 2 Y=f(A，B)響應(yīng)面立體圖及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects of precipitant concentration and temperature on protein precipitation

圖 3 Y=f(A，C)響應(yīng)面立體圖及等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots showing the effects of precipitant concentration and centrifuge speed on protein precipitation

圖 4 Y=f(B，C)響應(yīng)面立體圖及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of temperature and centrifuge speed on protein precipitation

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖，運(yùn)用Design Expert 7.0軟件對(duì)模型進(jìn)行分析，尋求蛋白質(zhì)含量的穩(wěn)定點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的因素水平，由圖2～4可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)即極大值點(diǎn)，通過(guò)對(duì)回歸模型求一階偏導(dǎo)，得到各因素A、B、C的編碼值為0.1588、0.2283、0.3160，利用編碼公式Xi=(Xj－X0)/Δj將上述編碼值轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)際參數(shù)為TCA質(zhì)量濃度8.320g/100mL、沉淀溫度47.280℃、離心轉(zhuǎn)數(shù)1726.060r/min，考慮實(shí)際操作性，將各沉淀工藝參數(shù)修正為TCA質(zhì)量濃度8.3g/100mL、沉淀溫度47℃、離心轉(zhuǎn)數(shù)1726r/min。此時(shí)蛋白質(zhì)沉淀效果最佳，為23.29g/100g。為了檢驗(yàn)回歸模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在所得最佳沉淀?xiàng)l件下進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，沉淀中蛋白質(zhì)實(shí)際含量分別為23.12、23.09、23.18g/100g，與預(yù)測(cè)值十分接近，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際蛋白質(zhì)沉淀情況。

2.3 豆醬中游離氨基酸含量測(cè)定

圖 5 處理后豆醬中游離氨基酸測(cè)定色譜圖Fig.5 Chromatogram of free amino acids in fermented soybean paste after protein removal

采用最佳蛋白質(zhì)沉淀操作條件處理后，按照1.3.5節(jié)方法測(cè)定樣品中游離氨基酸含量，結(jié)果見圖5。

由圖5可以看出，豆醬中的氨基酸分離效果很好，并且在檢測(cè)過(guò)程中柱壓穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化豆醬中蛋白質(zhì)沉淀?xiàng)l件，得出沉淀工藝條件參數(shù)為TCA質(zhì)量濃度8.3g/100mL、沉淀溫度47℃、離心轉(zhuǎn)數(shù)1726r/min，此條件下蛋白質(zhì)沉淀量可達(dá)到23.29g/100g。并采用此法沉淀蛋白質(zhì)后進(jìn)行豆醬中游離氨基酸含量測(cè)定，各氨基酸分離效果很好，并且柱壓穩(wěn)定，由此可知樣品中的蛋白充分的得到清除。

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