高效液相色譜法測定水產品中喹乙醇代謝物殘留量

貝亦江，王 揚，何 豐，任勝蘭

(1.浙江省水產質量檢測中心，浙江 杭州 310012；2.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江 杭州 310023)

喹乙醇是一種飼料添加劑，對大多數動物有明顯的致畸作用，對人也有潛在致畸形，致突變，致癌作用，因此在世界范圍內都被禁止或限制用作飼料添加劑[1]。3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)是喹乙醇主要代謝產物之一，在體內相對穩定，是國際食品法典委員會認定的標示殘留物之一，可作為殘留分析監控的目標物質。

常用M Q C A 的檢測方法是高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法[2-7]和液相色譜-串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法[8-13]。雖然LC-MS/MS法提高了定性、定量的準確性和靈敏度，但是儀器價格昂貴，檢測成本較高，在推廣程度上受到限制。HPLC法在使用上較為方便、快捷，靈敏度能達到檢測要求，但是按國標法操作，通過萃取和反萃取，生物體的蛋白質和脂類難以有效去除，造成上機液的污染，被檢物質本身也在此過程中損失較多，對檢測結果和儀器本身都不利。

本實驗參考前人的研究，采用與國標法不同的HPLC法對不同類型水產品(魚類、甲殼類、爬行類)中MQCA殘留量進行測定，對樣品前處理過程進行優化，以期提高回收率，得出方法的檢出限和定量限，為獸藥監管部門對喹乙醇流通的監管提供參考方法和依據，也為喹乙醇及其代謝物在生物體內的藥物動力學研究提供實驗手段[14-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MQCA標準品(＞94.0%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司。

甲醇、乙酸乙酯、甲酸(均為色譜純) 美國Tedia公司；鹽酸(分析純) 杭州化學試劑有限公司；乙酸鈉(分析純) 溫州潤華化工實業公司。

MQCA標準儲備液：稱取適量MQCA標準品，用流動相(甲醇-1.0%甲酸溶液(40：60，V/V))溶解，配制成100μg/mL標準儲備液，4℃避光冷藏，有效期12個月。

標準中間液：吸取1.00mL MQCA標準儲備液至100mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，配制成1.0μg/mL標準中間液，4℃避光冷藏，有效期3個月。

標準工作液：吸取一定量的標準中間液，用流動相稀釋至1.00mL，配制成0.01、0.05、0.25、0.5、1.0μg/mL系列梯度的標準工作溶液。

提取液：2.0mol/L鹽酸水溶液；淋洗液：0.05mol/L乙酸鈉-甲醇溶液(稱取4.10g乙酸鈉用甲醇稀釋至1.00L)；洗脫液：2%甲酸-乙酸乙酯溶液(量取20.00mL甲酸用乙酸乙酯稀釋至1.00L)。

1.2 儀器與設備

1200型高效液相色譜儀(配可變波長紫外檢測器) 美國Agilent公司；Oasis MAX 3cc固相萃取柱 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-1.0%甲酸溶液(40：60，V/V)；流速1.0mL/min；柱溫30.0℃；進樣量20.0μL；檢測波長320nm。

1.3.2 樣品制備

取新鮮或冷凍的供試組織，去除脂肪和筋膜，魚肉、龜鱉肉去皮，蝦、蟹去殼，切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊后混勻，充分勻漿。

1.3.3 樣品提取

稱取5.00g樣品置于50mL離心管中，加入15mL 2.0mol/L鹽酸溶液，根據試樣物理性質，漩渦混合1～2min。混合完畢后，置于氣浴恒溫振蕩器中60℃恒溫酸解30min，然后8000r/min離心10min。上清液過濾收集于另一支50mL離心管中。將過濾完畢的殘渣再次加入10mL 2.0mol/L鹽酸溶液，8000r/min離心5min，上清液過濾后收集于同一支50mL離心管中。

1.3.4 樣品凈化

固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化。待活化液流至填料上層以下，加入樣品提取液，控制流速不大于3mL/min。待樣品提取液全部流出后用10mL 0.05mol/L乙酸鈉-甲醇溶液淋洗固相萃取柱。待固相萃取柱中溶液全部流出后，抽真空5min。用10mL含2%甲酸的乙酸乙酯溶液洗脫。洗脫液收集于15mL玻璃離心管中，40℃氮氣吹干。殘渣加入1mL流動相渦旋振蕩2min溶解，過0.22μm濾膜后待測。

2 結果與分析

2.1 喹乙醇代謝物標準溶液和樣品色譜圖

標準物質譜圖如圖1A所示，陰性樣品添加20μg/kg MQCA得到譜圖如圖1B、1C所示。

圖 1 1.0μg/mL喹乙醇代謝物標準品(A)、陰性樣品添加水平20μg/kg(B)和陰性樣品(C)色譜圖Fig.1 Chromatogram of 1.0 μg/mL MQCA standard (A), blank sample spiked with 20 μg/kg MQCA (B) and blank sample (C)

2.2 樣品分析

向不同水產品(魚類、爬行類和甲殼類)樣品添加3個水平的MQCA標準物質，每個水平設6個平行，進行回收實驗。方法的回收率和精密度見表1。

由表1可見，在3個加標水平下，回收率在71.0%～ 86.5%之間，相對標準偏差在3.84%～7.32%之間。

表1 回收率和精密度記錄Table 1 Recovery rate and precision of the method

2.3 喹乙醇代謝物的標準工作曲線

對0.01、0.05、0.2、0.5、1.0μg/mL系列標準工作液進行色譜分析，按其所得峰面積的平均值與對應標準溶液的質量濃度作標準曲線。喹乙醇代謝物在質量濃度0.01～1.0μg/mL的范圍內呈線性關系，線性方程為y=43.972x＋0.0321，r=0.9998。

2.4 檢出限和定量限

在色譜條件下，按試驗方法規定的稱樣量和定容體積進樣測定。根據檢測限測定信噪比應大于3，定量限測定信噪比大于10的原理，計算檢出限為4.0μg/kg，定量限為12.0μg/kg，與國標方法[2]相符合，完全滿足國內水產品中MQCA的檢測要求。

2.5 提取方式的優化

現階段，水產品喹乙醇代謝物殘留量的檢測主要依據農業部1077號公告-5—2008《水產品中喹乙醇代謝物殘留量的測定高效液相色譜法》[2]。該方法雖然較為簡便，但是對于樣品的前處理考慮得并不周全。經過實際操作發現有以下缺點：1、在萃取和反萃取的過程中，試樣容易損失；2、當試樣組織密度較小，懸浮或漂浮于提取液中時，容易堵塞濾膜，造成過濾的不充分，從而使上機液不潔凈，非但影響回收率而且會對色譜柱造成損害。

張小軍等[4]提出，用鹽酸水解提取MQCA，陰離子固相萃取柱凈化。實驗發現，提取過程中增加一步提取+振蕩＋離心，并將酸解時間從60min縮短至30min，回收率顯著提高。而過濾的過程并不是必須的，因為過濾會降低回收率。只有樣品提取液非常不潔凈，有肉眼能分辨的顆粒狀、絮狀懸浮物將引起SPE柱堵塞的時候，才需要過濾。增加提取步驟縮短酸解時間以及是否過濾引起的回收率變化見表2、3。

由表2可見，增加提取步驟、縮短酸解時間前后回收率平均提高6.4%。由表3可見，不進行過濾相對于過濾，回收率平均提高13.0%。但由于實際樣品并非像空白樣品般鮮有雜質，因此在回收率符合要求的情況下，樣品均要過濾。

表2 增加提取步驟、縮短酸解時間前后的回收率變化Table 2 Influence of more complicated extraction procedure and shorted hydrolysis time on the recovery of MQCA

表3 空白樣品過濾前后的回收率變化Table 3 Influence of filtration on the recovery of MQCA

2.6 凈化方式的優化

固相萃取的主要目的是去除上機液雜質并使得上機液澄清而不使色譜柱受損。實驗發現，提取液通過SPE柱的速度對回收率有顯著影響，速度控制在不大于1滴/s。若提取液過快通過SPE柱，則介質對目標化合物的吸附將不充分，造成目標化合物的損失，淋洗和洗脫同理。在洗脫的過程中，注意洗脫液的用量不能太少，10～15mL較為合適(小于10mL洗脫不充分，而大于15mL則要超出玻璃離心管的容積)。

3 結 論

本實驗對前人關于水產品中MQCA殘留量的檢測方法進行探討，對前人的方法加以改進，增加了一次酸解提取步驟，減少了酸解時間；實驗結果表明，樣品不過濾時的回收率較過濾時差異較大，為水產品MQCA殘留量檢測的方法提供了建設性意見。

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[2] 全國水產標準化技術委員會. 農業部1077號公告-5—2008 水產品中喹乙醇代謝物殘留量的測定高效液相色譜法[S].

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