REP-PCR及ERIC-PCR法對分離自海產品副溶血性弧菌分型分析

馬月姣，孫曉紅*，趙 勇，盧 瑛，吳啟華，潘迎捷

(1.上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；2.緬因大學食品科學與人類營養系，美國 歐洛諾 04469)

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽細菌，廣泛分布于近海岸的海水，海底泥沙，浮游生物和魚、蝦、貝類等海產品中，是引起食源性疾病的重要病原之一[1]，尤其在夏秋季節的沿海地區常常引起暴發性食物中毒事件[2]。1950年副溶血性弧菌首次于日本一起食物中毒事件的食物中分離得到[3]，1996年出現O3：K6大流行菌群[4]，1998年由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件已超過沙門氏菌引起中毒事件[5]，副溶血性弧菌成為主要的食源性致病菌。

快速、準確地對副溶血性弧菌進行細致分型及比較菌株間親緣關系，對副溶血性弧菌流行病學調查、預防和控制具有重要意義。傳統上采用以表型特征為特點的生化鑒定和血清型分析方法對副溶血性弧菌進行分類、鑒定研究，但表型易因環境的變化而發生變異[6]，給菌株鑒定帶來困難，血清分型對不同來源的菌鑒別能力有限，且這兩種檢測方法操作復雜、耗時長。從基因水平進行分型可從根本上區分菌株的差異，且結果比傳統的方法更具可信性[7]。基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術的快速擴增方法(rapid PCR)包括隨機擴增多態性DNA分析(random amplified polymorphic DNA，RAPD)或隨機引物PCR (arbitrarily primed-PCR，AP-PCR)、腸內細菌基因組間重復序列分析(enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-PCR，ERIC-PCR)和細菌基因外重復回文序列擴增(repetitive extragenic palindromic-PCR，REP-PCR)等較多用于微生物的鑒定、分類和分型研究[8]，由于ERICPCR、REP-PCR 擴增引物較長(22個寡聚核苷酸)，因此相對于RAPD(引物為10個寡聚核苷酸)可產生較高重復性和一定特異性的DNA指紋圖譜[9]。其中REP家族由長38bp序列構成，含有6個保守位點；ERIC是廣泛存在于腸道細菌中的重復序列，長約124～127bp，其中心存在高度保守長約40bp的核心序列[10]，兩個重復序列在腸道細菌基因組中存在著屬、種、菌株水平上的分布和拷貝數量的差異[11]，這些重復序列本身在進化過程中具有較強的保守性，且由于此兩種方法具有快速、簡單、分辨率高和使用設備簡單等優點，已經廣泛用于病原菌的分型中[12]。因此本實驗采用REP-PCR和ERIC-PCR兩種分型方法鑒定上海市水產品分離副溶血性弧菌菌株的聚類特點及tdh+株與tdh-株的關系，旨在為副溶血性弧菌的分類及其疾病監控方面的研究提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：88株副溶血性弧菌，其中2株標準株ATCC33846(編號1，tdh+，下同)、ATCC33847(2，tdh+)中國科學院微生物研究所；13株實驗室保存菌株(3～15，3和5為tdh+)于2009年海產品中分離得到；73株分離菌株(16～88，其中46、65、71為tdh+)于2011年海產品中分離得到。

培養基：TSB培養基(含3% NaCl)、TSA培養基(含3% NaCl)、TCBS培養基、弧菌顯色培養基 北京路橋技術有限公司；DNA提取試劑盒DNA iso Reagent、PCR擴增體系、Agarose D-1 LE瓊脂糖凝膠粉 寶生物工程(大連)公司；1kb-plus DNA Maker 天根生化科技(北京)有限公司。

REP-PCR 及ERIC-PC 擴增引物[11]：REP1：5′-IIIICGICGICATCIGGC-3′、REP2：5′- ICGICTTATCIGGCCTAC-3′(I為次黃嘌呤)、Eric1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGATTCAC-3′、Eric2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGT GAGCG-3′ 上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

Mastercycler epgradient S PCR儀 德國Eppendorf公司；凝膠電泳儀、凝膠自動成像系統 美國Bio-Rad公司；Nanodrop 2000 微量分光光度計 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

取經活化純化后過夜培養的副溶血性弧菌菌液，按照微生物DNA提取試劑盒說明提取副溶血性弧菌基因組DNA。

1.3.2 DNA的質量檢測及質量濃度測定

測定所提取的副溶血性弧菌基因組DNA在260nm和280nm波長處的吸光度及其比值，同時測定DNA質量濃度。

1.3.3 REP-PCR體系

2.5μL 10×PCR緩沖液(含Mg2+)、2μL dNTP，引物(10μmol/L)各1μL、0.5μL Taq酶(5U/μL)、150ng DNA模板，以滅菌雙蒸水補齊25μL。PCR擴增條件：95℃預變性7min、90℃變性30s、40℃退火1min、65℃延伸8min、65℃總延伸16min，30個循環，10℃保存。使用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，緩沖液為1×TAE，120V恒壓電泳，電泳約60min后使用溴化乙錠染色15min后進行成像觀察并保存。

1.3.4 ERIC-PCR體系

2.5μL的10×PCR緩沖液、2μL dNTP、引物(10μmol/L)各1μL、0.5μL Taq酶(5U/μL)、150ng DNA模板，用經滅菌的去雙蒸水補齊25μL。PCR擴增條件：95℃預變性7min、94℃變性1min、52℃退火1min、剩余操作同1.3.3節“40℃退火1min”之后操作。

1.3.5 重復性及穩定性實驗

在相同試劑、儀器及操作條件下隨機抽取10個樣品重復3次，以驗證REP-PCR和ERIC-PCR擴增的可重復性及穩定性。

1.3.6 數據處理

取8μL的擴增產物，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測其基因圖譜條帶，以分子質量大小相同的條帶作為相同性狀，陽性結果記為1，陰性結果記為0，使用Gel-pro 4.5軟件分析，條帶強弱統一定義為6.9，將輸出的結果以Dice為系數采用非加權平均法(UPGMA)利用SLT-NTsys-2.10e軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 DNA質量及定量

通過測定，基因組DNA在260nm和280nm波長處的吸光度的比值介于1.8～2之間，DNA純度達到要求。將DNA質量濃度統一調整至50ng/μL，方便PCR體系加樣操作。

2.2 REP-PCR擴增結果

圖 1 副溶血性弧菌REP-PCR結果圖 Fig.1 REP-PCR fingerprint of Vibrio parahaemolyticus

圖 2 副溶血性弧菌REP-PCR聚類圖Fig.2 Cluster analysis based on REP-PCR fingerprint of Vibrio parahaemolyticus

REP-PCR的擴增圖譜結果顯示，88株副溶血性弧菌基因組DNA通過REP-PCR擴增，供試菌株能擴增出5～9條大小在609～4200bp之間的條帶呈現不同程度的基因多態性(部分菌株指紋圖譜擴增結果見圖1)。指紋圖譜中都擴增出609bp大小的條帶，90%以上均攜帶4200、3500bp和1900bp這3條條帶。通過NTSYS-pc軟件，根據非加權平均法(UPGMA)計算得到聚類樹狀圖(圖2)分析指紋圖譜，聚類圖結果顯示88株副溶血性弧菌在相似指數為0.70處分為5個群12個類型(表1)，區分指數達0.93，其中遺傳多樣性優勢群I占菌株數量的93.2%(82/88)，可細分為8個類型，7株tdh+株于相似系數為0.86時即可聚類在第I群的1、2類型中。

表1 副溶血性弧菌REP-PCR分型分布情況Table 1 REP-PCR type distribution of Vibrio parahaemolyticus

2.3 ERIC-PCR擴增結果

圖 3 副溶血性弧菌ERIC-PCR結果圖Fig.3 ERIC-PCR fi gureprint of Vibrio parahaemolyticus

圖 4 副溶血性弧菌ERIC-PCR聚類圖Fig.4 Cluster analysis based on ERIC-PCR fi ngerprint of Vibrio parahaemolyticus

表2 副溶血性弧菌ERIC-PCR分型分布情況Table 2 ERIC-PCR type distribution of Vibrio parahaemolyticus

對88株副溶血性弧菌進行ERIC-PCR擴增，供試菌株能擴增出5～11條大小在400～7593bp之間的條帶(部分菌株指紋圖譜擴增結果見圖3)，指紋圖譜中都可擴增出7593、2869bp和1479bp大小的條帶，90%以上菌株攜帶4004bp大小條帶。通過聚類分析結果顯示在相似系數為0.70處分為7個群11個類型(表2)，其鑒別指數為0.94。其中遺傳多樣性優勢群II占48.9%(43/88)，7株tdh+株在相似系數0.76時可聚類在第I群的1、2類型中。同REP-PCR分型相比鑒別指數類似，但重復實驗結果表明ERIC-PCR其重復性較REP-PCR差。

3 結論與討論

傳統微生物分類一般采用以表型特征為特點的生化鑒定和血清分型方法，表型易受環境變化的影響發生變異[6]，給菌株鑒定帶來困難。隨著分子分型技術的發展，傳統方法的不足得到彌補，且分子分型技術操作簡單快捷，區分指數較高。

本實驗采用ERIC-PCR和REP-PCR兩種方法對上海市海產品分離副溶血性弧菌分型均可得到清晰的基因指紋圖譜。在一定范圍內，DNA 條帶的大小和多少代表著此重復序列間的距離和重復次數。88株副溶血性弧菌的REP-PCR指紋圖譜中都擴增出609bp大小的條帶，90%以上均攜帶4200、3500bp和1900bp這3條條帶；ERIC-PCR指紋圖譜中都可擴增出7593、2869bp和1479bp大小的條帶，90%以上菌株攜帶4004bp大小條帶，這些普遍擴增出的條帶所攜帶的信息與副溶血性弧菌的種屬特性關系值得進一步分析。

聚類結果顯示ERIC-PCR的區分指數為0.94，與Bhowmick等[13]的研究結果一致，REP-PCR區分指數為0.93，二者辨別指數基本相當，這與Maluping等[14]報道的對菲律賓副溶血弧菌分離株的分型結果類似。另有研究指出此兩種快速PCR擴增方法的區分指數僅次于脈沖場凝膠電泳[15-16]，但就設備要求簡單、操作簡單快速方面和廣泛實用性是脈沖場凝膠電泳無法相比的。本實驗結果表明ERIC-PCR可重復性相對REP-PCR較差，即同一株菌指紋圖譜前后可能不一致而造成分型誤差，因此需要進行多次重復實驗進行分析來提高分辨率，這樣一來則不適合大量菌株的分類分析。因此REP-PCR用來對環境分離大量副溶血性弧菌進行分型更為可靠實用。

本實驗還發現REP-PCR和ERIC-PCR兩種方法分別在相似系數0.86和0.76處均可將5株均為分離的tdh+菌株和2株標準菌株聚類到同一個群中，顯示了很好的聚類能力。而在此之前的研究中，Zhao Feng等[17]從288個貝類樣品中分離得到的172株副溶血性弧菌中2株為tdh+菌株，通過RAPD分型發現此2株tdh+菌株與4株臨床分離菌株中的2株即編號為1.1615和1.1616顯示出一致的RAPD基因譜圖而聚類在同一群中。Hara-Kudo等[18]在對日本海域和海產品中副溶血性弧菌的調查過程中，通過AP-PCR即RAPD分型同樣發現14株tdh+菌株與大流行克隆菌株顯示了一致的基因譜圖，且發現血清型同為O3：K6的tdh-菌株與tdh+菌株通過分型聚類分析，結果顯示其親緣關系仍比較遠。Yang Zhenquan等[19]同樣在研究中發現通過RAPD分型，8株tdh+分離菌株中除一株編號為JRZCX05外，其他7株在遺傳水平上與臨床分離tdh+菌株高度相似，同時2株trh+分離株基因譜圖與臨床分離菌株ATCC17802基因圖譜一致即聚類在一起。以上研究均是以RAPD技術進行分型聚類，存在個別或一些菌株未能很好的聚類，說明RAPD分型方法對tdh+、tdh-菌株的分型聚類存在不足。而本實驗所采用的REP-PCR和ERIC-PCR分型方法則將5株分離的tdh+菌株與標準菌株很好的聚類在同一個群里，進一步證明REP-PCR和ERIC-PCR方法較RAPD方法具有可靠性和更好的分型能力。這可以為大量環境分離副溶血性弧菌的致病株檢測、調查和追蹤提供有利的基礎依據，也可為副溶血性弧菌的流行病學研究提供相關資料。

總之，REP-PCR和ERIC-PCR兩種方法具有有效性、操作簡易性、快速性和結果的可靠性，均可擴增出清晰的多態性條帶，可對副溶血性弧菌進行分類分析[20-21]。兩種方法均在較高的辨別指數下對環境分離tdh+副溶血性弧菌進行快速分型聚類研究[17-19]，且對發現新的菌株及對已知菌株作進一步的分析有很重要的現實意義，能成為副溶血性弧菌鑒別和分類的分子遺傳分析的有力工具。

[1] 趙富喜, 姜國樞. 醫學微生物學[M]. 上海： 上海醫科大學出版社, 2000： 135.

[2] 周庭銀, 趙虎, 馬于行. 秋季腹瀉中弧菌屬及氣單胞菌屬的分離與鑒定[J]. 中國醫學檢驗雜志, 1992, 15(1)： 31-32.

[3] HONDA T, IIDA T. The pathogenicity of Vibrio parahaemolyticus and the role of the thermostable direct haemolysin and related haemolysins[J]. Rev Med Microbiol, 1993, 4(2)： 106-113.

[4] OKURA M, OSAWA F, IGUCHI A, et a1. Genotypic analyses of Vibrio parahaernolyticus and development of a pandemic group specific multiplex PCR assay[J]. Clin Microbiol 2003, 4(1)： 4676-4682.

[5] 劉秀梅. 食源性疾病監控技術的研究[J]. 中國食品衛生雜志, 2004, 16(1)： 3-9.

[6] 李孝權, 劉衡川, 柴巧學, 等. 副溶血性弧菌食源性疾病分離株的RAPD分子分型研究[J]. 現代預防醫學, 2005, 32(7)： 726-728.

[7] 方偉, 楊杏芬, 柯昌文. 副溶血性弧菌分型研究進展[J]. 中華疾病控制雜志, 2008, 12(5)： 468-472.

[8] MALUPING R P, RAVELO C, LAVILLA-PITOGO C R, et al. Molecular typing of Vibrio parahaemolyticus strains isolated from the Philippines by PCR-based methods[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 99(2)： 383-391.

[9] 何培新, 劉偉, 郭恒, 等. REP- PCR技術在平菇栽培菌株鑒定中的應用[J]. 河南農業科學, 2008(2)： 78-81.

[10] 吳清平, 葉應旺, 張菊梅, 等. ERIC結構功能及ERIC-PCR技術的應用[J] .中國衛生檢驗雜志, 2006, 16(4)： 507-509.

[11] JAMES V, KOEUTH T, JAMES R L. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes[J]. Nucleic Acids Research, 1991, 19(24)： 6823-6831.

[12] MICHAEL O D, BEAN P. Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms[J]. J Clin Microbiol, 1999, 37(6)： 1661-1669.

[13] BHOWMICK P P, KHUSHIRAMANI R, RAGHUNATH P, et al. Molecular typing of Vibrio parahaemolyticus isolated from seafood harvested along the south-west coast of India[J]. Letters in Applied Microbiology, 2008, 46(2)： 198-204.

[14] MALUPING R P, RAVELO C, LAVILLA-PITOGO C R, et al. Molecular typing of Vibrio parahaemolyticus strains isolated from the Philippines by PCR-based methods[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 99(2)： 383-391.

[15] WONG H C, LIN C H. Evaluation of typing of Vibrio parahaemolyticus by three PCR methods using specific primers[J]. Clin Microbiol, 2001, 39(12)： 4233-4240.

[16] BARBIER N, SAULNIER P, CHACHATY E, et al. Random amplified polymorphic DNA typing versus pulsed-field gelelectrophoresis for epidemiological typing of vancomycin-resistant enterococci[J]. J Clin Microbiol, 1996, 34(5)： 1096-1099.

[17] ZHAO Feng, ZHOU Deqing, CAO Huihui, et al. Distribution, serological and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus from shellfish in the eastern coast of China[J]. Food Control, 2011, 22(7)： 1095-1100.

[18] HARA-KUDO Y, SUGIYAMA K, NISHIBUCHI M, et al. Prevalence of pandemic thermostable direct hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus O3：K6 in seafood and the coastal environment in Japan[J]. Appl Environ Microb, 2003, 69(7)： 3883-3891.

[19] YANG Zhenquan, JIAO Xin’an, ZHOU Xiaohui. et al. Isolation and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus from fresh, low-temperature preserved, dried, and salted seafood products in two coastal areas of eastern China[J]. Int J Food Microbiol, 2008, 125(3)： 279-285.

[20] MARSHALL S, CLARK C G, WANG G, et al. Comparison of molecular methods for typing Vibrio parahaemolyticus[J]. J Clin Microbiol, 1999, 37(8)： 2473-2478.

[21] STALEY C, HARWOOD V J. The Use of genetic typing methods to discriminate among strains of Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, and V. vulnifi cus[J]. J AOAC Int, 2010, 93(5)： 1553-1569.