金針菇液體菌種培養基及培養條件的優化

徐學鋒，沈敏，譚明艷，陳小燕

（華南農業大學食品學院，廣州，510642）

金針菇（Flammulina velutipes）是一種優質食用菌，富含蛋白質、氨基酸、維生素、礦質元素等多種營養物質[1]，以及樸菇素（Flammutn）、蒜菇素、金針菇原素（Flamn）等功能活性成分，具有抗腫瘤、調節免疫力、促進智力發育、護肝等作用[2]，早已成為人們熟知的保健食品。隨著技術的革新和國內外市場需求的增長，金針菇生產方式已由傳統作坊式、季節性生產，向設施化、工廠化生產方式轉變[3]。作為金針菇工廠化栽培的關鍵技術之一，液體菌種具有生產周期短、接種便利、菌絲分散性好、萌發點多、生長快、成品率高等優點，液體菌種的應用已成為食用菌菌種及規模化、工廠化生產的發展趨勢[4]。本研究采用液體搖瓶培養，對金針菇液體菌種的培養基和培養條件進行了優化，以期為金針菇栽培技術的提升提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

金針菇21，購自華中農業大學菌種實驗中心。

1.2 培養基

①碳源篩選培養基 在基礎培養基 （蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，維生素 B11 mg/L）中，分別加入2%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉4種碳源，121～126℃滅菌20 min，冷卻備用。

②氮源篩選培養基 在基礎培養基 （葡萄糖2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，維生素 B11 mg/L）中，分別加入2%的蛋白胨、酵母膏、麩皮3種氮源，滅菌，備用。

③培養條件優化培養基 玉米粉2%、麩皮1%、酵母粉0.5%、葡萄糖1%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、CaCO30.2%、維生素 B11 mg/L。

④固體菌種培養基 小麥98%、白糖1%、石膏1%。小麥在清水中浸泡6～8 h，吸足水分，然后煮熟（不開粒），撈出瀝干水，加入石膏粉、白糖拌勻，分裝瓶中，滅菌，備用。

⑤栽培培養基 棉籽殼培養基（干料）：棉籽殼78%、麩皮20%、蔗糖1%、CaCO31%，加水攪拌至含水量60%，裝袋（每袋折合干料300 g），滅菌，冷卻待用。

1.3 菌種活化

菌種斜面接種到PDA平板，25℃恒溫培養8 d，備用。

1.4 碳源、氮源的篩選

每種不同培養基設置3個重復，用直徑0.2 cm的打孔器在活化的菌種平板上打孔，搖瓶容量250 mL，裝液量70 mL，接活化菌種5塊，25℃靜置24 h后，150 r/min搖瓶培養5 d，觀察菌絲球形態，測定菌絲體生物量。

1.5 菌絲體生物量測定

取50 mL搖勻的培養液，過濾收集菌絲，蒸餾水洗滌至水變清后，將菌絲球置于恒重過的定性濾紙之上，于干燥箱60℃烘至恒重后稱量[5]。

1.6 液體菌種培養條件的優化

①一級種子的制備 將PDA活化的菌種經打孔后接種到液體培養基，恒溫25℃，150 r/min條件下培養2 d，作為種子備用。

②搖瓶發酵條件的優化 三角瓶容量250 mL，接種上述種子液進行搖瓶發酵，根據已有報道[5～7]，以搖床轉速、裝液量、接種量及培養溫度為4個因素，采用 L9（34）正交試驗設計，詳見表 1，共培養5 d，以菌絲體生物量為考察指標，進行培養條件優化，獲得最佳搖瓶發酵培養條件。

1.7 最佳接種菌齡的確定

發酵培養基在最優條件下制備液體菌種，菌齡分別設4、5、6 d三組，經輕微絞碎后，接種到棉籽殼培養基，每組20袋，觀察菌絲長滿所耗的時間及菌絲的生長狀況。

1.8 固體菌種的制備

將活化好的PDA菌種平板接種到麥粒菌種培養基，在25℃、相對濕度75%左右條件下培養至滿袋后，繼續培養1周，待用。

1.9 出菇試驗

分別將固體和液體菌種 （菌齡5 d）接種10 g（或10 mL）到棉籽殼培養基中，各50袋，24℃、相對濕度75%左右條件下培養至滿袋，繼續1周后轉入13～14℃菇房，相對濕度 85%～90%，出菇兩茬[8]，記錄長滿、現蕾時間及鮮菇產量，計算生物學效率，生物學效率（%）=子實體鮮質量/培養基干質量×100%。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對金針菇菌絲體生長的影響

表1 搖瓶培養條件優化L9（34）正交試驗設計

表2 不同碳源對金針菇21菌絲體生長的影響

以不同碳源進行金針菇液體培養均能收獲菌絲，但所得菌絲干質量差異較大（表2）。葡萄糖和蔗糖產生的菌絲體較少，分別只有1.136 2和1.051 1 g/100 mL，而天然性的碳源玉米粉和可溶性淀粉產生的菌絲體干質量較大，最多達1.630 5 g/100 mL，菌絲球的形態也較優。分析原因可能是天然成分中含有有利于菌絲生長的生長因子，而葡萄糖可能具有碳代謝抑制效應，形成反饋抑制作用，不利于碳源的吸收與利用。

2.2 不同氮源對金針菇菌絲體生長的影響

3種氮源中，NH4NO3組獲得的菌絲干質量最少，只有0.631 2 g/100 mL，說明NH4NO3被真菌菌絲利用得很少，在栽培過程中添加NH4NO3的意義也不大；蛋白胨作為一種半人工氮源，促進金針菇生長的作用表現一般；麩皮組中菌絲的得率最高，達1.531 9 g/100 mL，菌絲球的形態也最好，這與現實應用中常以麩皮作為輔助材料是一致的（表3）。

2.3 搖瓶培養條件的優化

①正交試驗結果 對轉速、裝液量、接種量、培養溫度4因素3水平的正交設計試驗優化結果見表4。極差分析表明，A>D>C>B，說明搖床轉速對液體菌種的菌體生長影響最大，其次為培養溫度，再次為種子液的接種量，裝液量對菌絲得率的影響最小。

理論最優的培養條件為A2B2C3D2，即搖床轉速150 r/min、裝液量 60 mL、接種量 12%、培養溫度22℃。

表3 不同氮源對金針菇21菌絲體生長的影響

表4 搖瓶培養條件優化L9（34）正交試驗結果

②驗證性試驗 為了進一步檢驗正交試驗結果的可靠性，按上述最優培養條件進行驗證試驗，3次重復，肉眼觀察發現菌絲球大小較均勻，濃度高，密度較大，經測定所得菌絲干質量為1.821 5 g/100 mL。結果表明，在優化后的培養條件下進行菌種液體培養具有較好的重復性，說明正交試驗結果是可信的。

2.4 液體菌種的應用

①最佳菌齡的確定 分別將經過4、5、6 d發酵的液體菌種接種到棉籽殼培養基上后，滿袋天數分別為27、25、28 d，其中發酵5 d的菌種滿袋所需時間最短，菌絲健壯，長勢旺。

②出菇試驗結果 栽培試驗中2種不同菌種接種的菌袋出菇過程的相關記錄見表5。液體菌種栽培袋長滿時間要比固體菌種提早9 d，頭潮菇采收早7 d，二潮菇早9 d，總產量約高出5.8%。

3 小結與討論

通過對不同碳源和氮源進行篩選，發現以玉米粉為碳源、麩皮為氮源制備金針菇21菌株液態菌種的效果較好。在此基礎上進行培養條件的優化，發現當搖床轉速150 r/min、裝液量60 mL（三角瓶，250 mL容量）、接種量12%、培養溫度22℃時所得液體菌種質量最優，菌絲干質量達1.821 5 g/100 mL。該條件下生產的液體菌種在出菇試驗后發現菌絲的生長時間、出菇時間都相應提前，有效地縮短了生產周期，并且產量有所提高。

碳源和氮源是食用菌最主要的營養物質，它們幾乎參與細胞代謝一切的過程。金針菇能利用的碳源和氮源范圍很廣[9]，通常復合型的優于單一型的，有機態優于無機態。本試驗篩選的結果顯示，較好的碳氮源分別是玉米粉和麩皮。除了碳、氮源等主要營養元素外，包括無機鹽、生長因子等其他營養成分對金針菇的生長發育的影響也十分明顯，不少研究者作了很多工作[5，9]。不同菌株特異性不同，所以在營養需求上略有差異，有必要從實驗室研究[10]和栽培實踐[7，11]兩方面協同深入。

表5 液體和固體菌種出菇比較

液體菌種的培養條件中溫度是相對較為敏感的因素，有研究者發現25℃是金針菇液體菌種的最適培養溫度[6，11]，本試驗發現最適溫度為 22℃，與黃仁術[5]的結果一致。本試驗優化后的最優轉速與陳力力等[6]和閆長偉等[7]的結果略有差異，極差分析顯示，轉速對菌種的影響最大，分析原因可能是正交設計的轉速差距較大造成的。搖瓶培養過程中，較高轉速通常會導致菌絲球過于緊密，限制其生長，從而影響菌絲生物量，相反，轉速過低又會影響營養物質的傳導和溶氧量，不利于生物量的積累和菌絲活力的保持。目前，生產實踐中，多采用發酵罐液體深層發酵，與搖瓶不同的是需要考察螺旋槳[11]對菌絲的剪切力和通氣量[10，12]等指標，較搖瓶發酵更為精確。

由于出菇試驗是小規模袋式栽培，管理過程中參數波動幅度較大[13]，導致兩組試驗總體的生物轉化率都偏低。另外，搖瓶發酵的液體菌種菌絲活力會略遜于液體深層發酵，使得液體菌種的優勢發揮也不充分。所以，出菇試驗的結果只是在一定程度上說明了液體菌種在栽培上有優勢，在生產實踐上的應用有待進一步細致深入的分析。

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