帶菌砧木種子和灌溉方式對西瓜嫁接苗細菌性果斑?。˙ F B）發生的影響

牛慶偉，蔣薇，孔秋生，黃遠，別之龍

（園藝植物生物學教育部重點實驗室/華中農業大學園藝林學學院，武漢，430070）

西瓜細菌性果斑病是由燕麥嗜酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenaesubsp.citrulli）引起的瓜類細菌性果腐病，簡稱BFB，該病是典型的由種子帶菌引起的傳染性病害，也是我國規定的檢疫性病害之一。該病最早于1969年由Crall和Schenck[1]在美國佛羅里達州發現，我國1985年發現并開始報道瓜類BFB的發生和為害[2～4]。BFB病菌寄主主要有西瓜、羅馬甜瓜、蜜露洋香瓜和網紋洋香瓜等，采用人工接種的方式其也可以感染其他葫蘆科作物，如黃瓜、甜瓜、節瓜、瓠瓜、南瓜、絲瓜、苦瓜、西葫蘆等[5]。BFB病菌主要附著在種子和病株殘體上越冬，種子帶菌為主要初侵染源，病菌隨風、雨或灌溉水從植株氣孔或傷口侵入，病菌在病株上大量繁殖擴展，造成再次侵染[6]。

近年來，越來越多的育苗工廠出現BFB的發生與流行，導致經濟損失嚴重。但到目前為止，對于BFB還沒有一種可以徹底控制的方法。研究BFB在西瓜嫁接育苗過程中的發生規律對防控西瓜BFB的發生與流行具有重要意義。研究表明，在西瓜嫁接育苗過程中帶菌接穗種子、帶菌育苗基質和帶菌嫁接用具均能導致嫁接苗BFB的發生[7～9]。帶菌砧木種子、灌溉方式對西瓜嫁接苗BFB發生的影響如何，目前尚不知曉。Bahar等[10]通過試驗證明BFB病菌能夠通過木質部導管向下和向上移動從而系統侵染甜瓜幼苗。本研究對西瓜砧木種子人工接菌，采用發病砧木幼苗與健康接穗幼苗為嫁接材料，初步探索BFB病菌在嫁接苗上的侵染途徑，研究帶菌砧木種子與西瓜嫁接苗BFB發生間的關系。曾義安等[11]曾指出土傳病害枯萎病、非土傳病害病毒病、霜霉病和灰霉病在嫁接植株上的病情指數和發病率均低于自根植株。本研究采用人工噴霧接種的方法鑒定不同類型嫁接苗對BFB的抗性。趙廷昌等[5]曾指出在溫室中，由于人工灌溉等原因，可使BFB病菌自然接種到同株葉片或鄰近的幼苗上，帶病幼苗移入田后，借雨水或噴灌水而傳播感染。本研究明確了不同灌溉方式與嫁接苗BFB發生間的關系，提出了有利于控制病害的灌溉方式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試砧木品種為京欣砧一號，購自北京京研益農科技發展中心。供試接穗品種為早佳“84-24”，購自新疆明鑫科鴻農業科技有限責任公司。育苗基質為草炭∶珍珠巖=2∶1（體積比）。西瓜BFB病菌為pslbtw20，該病原菌屬于Aac，由中國農科院植保所趙廷昌研究員惠贈。

供試培養基為KBA培養基：硫酸鎂1.5 g、磷酸氫二鉀 1.5 g、瓊脂 20 g、甘油 10 g、蛋白胨 20 g、蒸餾水 1 000 mL、pH 值 7.0～7.2。

1.2 試驗方法

①葉片發病情況分級標準和病情指數計算 葉片發病情況分級標準參考Hopkins等[12]的方法，0級：無?。?級：葉片病斑較少，病斑面積占整片葉面積的5%以下；3級：病斑較多，病斑面積占整個面積的5%～30%；5級：病斑較多，病斑面積占整個面積的30%～50%；7級：病斑很多或融合成大斑，病斑面積占整個面積的50%以上，葉片未焦枯死亡；9級：病斑很多或融合成大斑，病斑面積占整個面積的50%以上，常使葉片焦枯死亡。

病情指數參考翟艷霞[13]的計算公式：病情指數=∑（各級病葉數×各級代表值）/（調查總葉數×最高級代表值）×100。

②試驗地點 試驗在華中農業大學園藝植物生物學教育部重點實驗室和國家蔬菜改良中心華中分中心連棟玻璃溫室內進行。

③砧木種子接菌方法的篩選 挑選西瓜BFB病菌pslbtw20的單菌落，采用KBA液體培養基對西瓜BFB病菌進行培養 （28℃，220 r/min）， 使菌液OD600值達到 0.3～0.4（濃度約為 108cfu/mL），梯度稀釋濃度分別為 107cfu/mL、105cfu/mL、103cfu/mL的菌液。種子接菌參考馮建軍等[14]的浸種法并進行改進，按1 g砧木種子與2 mL不同濃度菌懸液的比例浸泡，分別振蕩 30、60 min（25℃、160 r/min），取出后于超凈工作臺晾干備用。帶菌種子浸種催芽后播種，置于25℃、RH 70%的人工氣候箱中培養，共6個處理，每個處理3次重復，每次重復50粒砧木種子。待砧木適合嫁接時統計砧木幼苗的發病率和子葉病斑面積＜5%的發病砧木幼苗株數。

④帶菌砧木種子與西瓜嫁接苗BFB發生間的關系 將1 000粒砧木種子按1 g種子與2 mL 105cfu/mL菌懸液的比例浸泡，振蕩30 min（25℃、160 r/min），于超凈工作臺過夜晾干。帶菌種子浸種催芽后播種，置于25℃、RH 70%的人工氣候箱中培養，6 d后培育西瓜接穗幼苗。待砧木適合嫁接時，選擇子葉病斑面積為5%左右的砧木幼苗，以無菌砧木幼苗為對照，采用頂插接和斷根插接的方法嫁接[15]，每個處理3次重復，每次重復20株。每天調查嫁接苗的發病癥狀，并統計發病率。

⑤不同類型西瓜嫁接苗對BFB的抗性鑒定采用斷根和頂插接兩種方法嫁接[15]，研究斷根嫁接苗和頂插接苗對BFB的抗性，以自根苗作為對照。試驗在玻璃溫室內進行，幼苗3葉1心期，采用pslbtw20菌懸液（108cfu/mL）噴霧法接種，薄膜保濕48 h，每個處理30株，3次重復。3 d后調查葉片的發病情況，第8天統計各處理病情指數。參考田英等[16]的相對抗病性方法評價嫁接苗的抗病程度，抗病程度分為免疫（I）、高抗（HR）、中抗（MR）、中感（MS）、感?。⊿）5 類，相對抗病指數分別為 1.00、0.80～0.99、0.40～0.79、0.20～0.39 和 0.20 以下。相對抗病指數=1-相對病情指數。相對病情指數=鑒定嫁接苗平均病情指數/對照自根苗平均病情指數。

⑥不同灌溉方式對西瓜嫁接苗BFB發生的影響 2葉1心期，嫁接苗噴霧接菌，第4天挑選病情指數相近的發病嫁接苗作為初侵染病株，移栽至健康嫁接苗群體，初侵染病株在穴盤中的分布位置如圖1所示，灰色為初侵染病株的位置，白色為健康嫁接苗的位置，初始發病率分別設置為0%、4%、12%和20%。試驗在人工氣候室內進行，采用不同的灌溉方式提供水分，試驗設計如表1所示，采用完全隨機區組設計，共設8個處理，3次重復，每重復種植一穴盤。9月5日進行第一次灌溉處理，以后每隔2 d灌溉一次，每次灌溉前統計穴盤內嫁接苗的發病率，9月15日試驗結束。分別于試驗開始時（9月5日）和試驗結束時（9月15日）統計初侵染病株的病情指數，計算BFB日增長速率。

圖1 初侵染病株在穴盤中的分布位置

病 害 日 增 長 速 率 的 計 算 公 式[17]：r=1/（t2-t1）×ln[X2（1-X1）/X1（1-X2）]。式中：r 為病害日增長率；X1為前1次調查的病情指數；X2為后1次調查的病情指數；t2-t1為2次調查之間的時間距。

2 結果與分析

2.1 砧木種子接菌方法的篩選

由表2可知，砧木種子接菌濃度越高、時間越長，幼苗發病率越高。 107cfu/mL（30 min、60 min）處理下，砧木發病情況嚴重，不存在可以嫁接的砧木幼苗；105cfu/mL（30 min）處理下，50 株砧木幼苗中有7株可以嫁接的發病砧木幼苗，能夠獲得更多適合嫁接的帶菌砧木幼苗。試驗采用砧木種子的接菌方法為：按1 g砧木種子與2 mL 105cfu/mL菌懸液的比例浸泡，振蕩 30 min（25℃、160 r/min），超凈工作臺過夜晾干。砧木種子人工接種試驗表明，帶菌砧木種子能夠導致砧木幼苗BFB的發生，帶菌砧木種子播種出苗后，果斑病病菌開始于子葉發病，子葉背面出現水漬狀病斑，隨著幼苗的生長，發病嚴重的砧木幼苗，病斑逐漸向葉基部侵染，并侵染莖部，最終砧木腐爛死亡。

2.2 帶菌砧木種子對西瓜嫁接苗BFB發生的影響

表2 砧木種子接菌方法的篩選

砧木種子帶菌導致砧木幼苗BFB的發生，選擇幼苗子葉病斑面積為5%左右的砧木幼苗和無菌接穗幼苗，采用頂插接和斷根嫁接的方法嫁接。結果發現，嫁接苗BFB發病率100%，砧木上的BFB病菌均可侵染至接穗（圖2），隨著病情發展，接穗子葉腐爛壞死，最終整株嫁接苗腐爛死亡。可見，砧木種子帶菌后BFB病菌通過嫁接傳遞可導致嫁接苗BFB的發生，不同嫁接方法與BFB的發生無顯著差異。

2.3 不同類型的西瓜嫁接苗對BFB的抗性鑒定

BFB病菌接種于不同類型的西瓜嫁接苗，幼苗從第3天開始發病，病葉初期呈現少量水浸狀病斑，呈不規則形，暗青色，水浸狀病斑通常沿葉脈發展，中期病斑由暗青色至暗棕色，嚴重時，沿葉脈發展到葉基部，葉片焦枯死亡。第8天進行相對抗病性分析，自根苗、頂插接苗和斷根嫁接苗的病情指數分別為 73.1、67.9 和 71.4（圖 3），頂插接苗和斷根嫁接苗的相對抗病指數分別為0.07和0.02，均為感病類型?？梢?，嫁接苗和自根苗在苗期對于BFB的抗性沒有差異，嫁接不能提高西瓜對BFB的抗病性。

2.4 不同灌溉方式對嫁接苗BFB發病率的影響

由圖 4可知，A1、B1（對照）處理嫁接苗 BFB發病率為0。A2、A3、A4的發病率從第4天開始不斷增加，B2、B3和B4發病率基本穩定不變。 第 10天，B2、B3、B4、A2、A3和 A4的 發 病 率 分 別 增 加 了 0.7、0.7、0.7、3.3、7.3 和 12 個百分點。 采用上部噴灌的方式有利于細菌性果斑病的傳播，而且初侵染源越多病害傳播的規模就越大。

2.5 不同灌溉方式對初侵染病株病情擴展的影響

由表 3 可知，試驗開始時 A2、A3、A4、B2、B3和 B4初始病情指數無顯著差異，試驗結束時A2、A3、A4的病情指數顯著高于B2、B3、B4的。病情指數的日增長率為 A2＞A3＞A4＞B2＞B4＞B3。 由此可見，采用上部噴灌方式提供水分，發病植株病情指數迅速提高，能夠加速病情的惡化，潮汐灌溉能夠減緩病害的擴展。

3 結論與討論

BFB為害在我國各西瓜產區均有報道，接穗種子帶菌是導致嫁接苗感染BFB的主要原因，帶有BFB的西瓜種子經西瓜嫁接苗育苗場造成的毀苗率高達 30%～80%[18，19]。 本研究結果表明，在西瓜嫁接育苗過程中，砧木種子接菌濃度從103～107cfu/mL均可造成砧木幼苗BFB的發生，濃度越大發病率越高。本試驗研究發現，砧木種子帶菌后通過系統侵染會導致砧木幼苗BFB的發生，以發病砧木幼苗和健康接穗幼苗為嫁接材料，BFB病菌通過嫁接傳遞可導致嫁接苗BFB的發生，表明砧木種子可能成為西瓜嫁接苗BFB發生的來源。Tian等報道2012年7月在安徽省發現因南瓜砧木種子帶菌導致西瓜嫁接苗BFB的發生現象。閻莎莎等[20]指出Aac有單根極生鞭毛，其鞭毛在侵染過程中有重要的作用，IV型菌毛可幫助病菌定殖和在維管束導管中移動。由此推測，砧木上BFB病菌可能通過木質部導管侵染至接穗。

圖2 砧木幼苗發病時BFB病菌從砧木侵染至接穗的癥狀

圖3 不同類型嫁接苗人工噴霧接種后的病情指數比較

圖4 不同處理對嫁接苗BFB發病率的影響

劉龍洲等[21]在甜瓜嫁接育苗實踐中發現，對于白粉病（氣傳葉部病害）而言，以商業甜瓜品種為接穗，部分甜瓜材料為砧木，嫁接苗比自根苗的抗性強。張繼梅等[22]指出，嫁接可以有效防治枯萎病的發生，而且嫁接后西瓜苗的葉部病害抗性能力顯著增強。BFB雖然是一種細菌性種傳病害，但是該病菌可侵染葫蘆科作物葉片，引起葉部病害，本研究鑒定了嫁接苗對BFB的抗性水平，結果表明，嫁接苗和自根苗在苗期對BFB的抗性沒有差異，嫁接沒有提高西瓜苗對BFB的抗性。Silva等[23]指出BFB病菌可以侵染甜瓜葉片，而且優先定殖于葉片的毛狀體基部、氣孔的邊緣和表皮細胞間隙。韓曉燕[24]指出利用抗病砧木進行嫁接可以增強蔬菜作物對多種病害的抗性，但砧木對所抗病害的種類有一定的選擇性。由此可知，嫁接苗和自根苗對BFB抗性無顯著差異可能與嫁接苗葉片結構、砧木對BFB的抗性和BFB病菌的侵染特性有關。目前，還沒有發現BFB的抗性砧木，在嫁接育苗過程中避免菌源的進入對于嫁接苗BFB的防治至關重要。

上部噴灌是工廠化育苗過程中常用的灌溉方式之一，但采用上部噴灌容易造成溫室內高濕的環境條件，利于病蟲害的發生和擴展。當前，BFB已成為威脅嫁接苗生產的主要病害，BFB病菌通過上部噴灌的方式在嫁接育苗場內不斷傳播與擴展，給嫁接育苗場造成了巨大的經濟損失，急需一種科學、合理、防病的灌溉方式。楊仁全等[25]指出潮汐灌溉是針對容器育苗所設計的底部給水的灌溉方式，潮汐灌溉使棚內相對濕度容易控制，可保持作物葉面干燥，是一種節能、環保、高效的灌溉技術。本研究結果表明，與潮汐灌溉相比，采用上部噴灌的方式有利于BFB的傳播，而且初侵染源越多，病害傳播的規模越大，發病植株病情惡化迅速，采用潮汐灌溉可有效地控制BFB的發生與擴展。

在西瓜嫁接育苗過程中，砧木種子帶菌后通過嫁接傳遞可導致嫁接苗BFB的發生，不同嫁接方法對BFB的發生無顯著差異。與上部噴灌相比，潮汐灌溉能有效地控制嫁接苗BFB的發生。

表3 初侵染病株病情指數及其日增長率

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